产品简介
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）（EC 4.1.1.31）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸呈不可逆反应的酶，对三羧酸循环的运转起重要调节作用。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法，用于检测各种生物样本PEPC活性。其原理是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO2生成草酰乙酸和HPO42-，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，NADH在340nm有特征吸收峰，而NAD+没有，通过测定340nm光吸收下降速率，即可计算PEPC活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 8mL | 16mL | 4℃保存 |
试剂二 | 0.85mL | 1.7mL | -20℃避光保存 |
试剂三储液 | 5µL | 10µL | 4℃避光保存 |
试剂三稀释液 | 2.5mL | 5mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）及恒温箱
96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前配制，用试剂一将试剂二稀释10倍，即取1倍体积的试剂二加入9倍体积的试剂一。
试剂三：临用前配制，用试剂三稀释液将试剂三储液 稀释400倍，即取1倍体积的试剂三储液加入399倍体积的试剂三稀释液。
样本制备
1．动物组织样本：按照0.1g组织加入1mL预冷的提取液的比例，冰浴匀浆。8,000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2．植物组织样本：按0.1g组织加入1mL预冷的提取液的比例，冰浴匀浆后超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。8,000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
1．细胞或细菌样本：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL预冷的提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
2．血清（浆）样本：直接检测。
注意：1. 推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
2.对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外分光光度计去离子水调零。
2. 稀释后的试剂二和试剂三置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热5min以上。
3. 样本测定：在96孔UV板或微量石英比色皿中加入10μL样本、20μL稀释后的试剂三、170μL稀释后的试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和5min 20s后的吸光值A2，计算ΔA测定=A1-A2。
注意：1. 需使用96孔UV板或微量石英比色皿，实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于0.5，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1、血清（浆）PEPC活力计算
单位定义：pH8.0条件下，每mL血清（浆）每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPC（U/mL）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=1286×ΔA
2、组织、细菌或细胞中PEPC活力计算
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPC（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样)÷T=1286×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPC（U/g鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=1286×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每1万个细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
PEPC（U/104 Cells）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=2.572×ΔA
ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 mol/L/cm；V反总：反应总体积，200μL=2×10-4 L；V样本：加入样本体积，0.01mL；V样总，加入提取液体积，1mL；cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；d：96孔板光径，0.5cm；T：反应时间，5min；500：细菌或细胞总数，500万。
B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
