产品简介
动物肝脏、肾脏是氨基酸代谢的主要器官，故尿中氨基酸的变化最能反应肝、肾的生理状态。另外，氨基酸还能反应灼伤、伤寒等方面情况。植物体内氨基酸含量对研究植物在不同条件下及不同生长发育时期氮代谢变化、植物对氮素的吸收、运输、同化及营养状况等有重要意义。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测各种生物样本中氨基酸含量，其原理是氨基酸的α-氨基可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物，在570nm处有特征吸收峰；通过测定570nm吸光度，来计算氨基酸含量
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48 T | 96 T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
反应缓冲液 | 5mL | 10mL | 4℃保存 |
1 | 1 | 4℃避光保存 | |
标准品（10mg半胱氨酸） | 1 | 1 | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测570nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机
去离子水、乙醇
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
显色物：临用前配制，96T加入4mL 95%乙醇充分溶解，48T加入2mL 95%乙醇充分溶解，未用完的已溶解的显色物可4℃避光保存一周。若需长期保存，请分装后-20℃保存，避免反复冻融。
标准品：临用前配制，加2.066 mL去离子水，充分溶解得到40μmol/mL标准品，未用完的已溶解的标准品可4℃避光保存一周。若需长期保存，请分装后-20℃保存，避免反复冻融。
标准曲线设置：把40μmol/mL标准品按下表所示，用去离子水进行下一步稀释。
标准品体积 | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（μmol/mL） | |
Std.1 | 200µL of 40μmol/mL | 0 | 40 |
Std.2 | 100µL of Std.1（40μmol/mL） | 100 | 20 |
Std.3 | 100µL of Std.2（20μmol/mL） | 100 | 10 |
Std.4 | 100µL of Std.3（10μmol/mL） | 100 | 5 |
Std.5 | 100µL of Std.4（5 μmol/mL） | 100 | 2.5 |
Std.6 | 100µL of Std.5（2.5 μmol/mL） | 100 | 1.25 |
Std.7 | 100µL of Std.6（1.25 μmol/mL） | 100 | 0.625 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
动物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，室温下充分匀浆，转移到 1.5mL EP 管中，盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴15min；自来水冷却后，10,000rpm，室温离心10min，取上清液待测。
植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL 提取液捣碎，室温超声波破碎 5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），转移到1.5mL EP 管中，盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴15min；自来水冷却后，10,000rpm，室温离心10min，取上清液待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，室温超声波破碎5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），转移到 1.5mL EP 管中，盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴15min；自来水冷却后，10,000rpm，室温离心10min，取上清液待测。
液体：吸取0.5mL液体加入0.5mL 提取液，盖紧后（防止水分散失）置于沸水浴15min；自来水冷却后，10,000rpm，室温离心10min，取上清液，待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。
若需测定样本蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到570nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
试剂名称 | 空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） |
去离子水 | 10 | 0 | 0 |
不同浓度标准品 | 0 | 10 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 10 |
显色物 | 20 | 20 | 20 |
反应缓冲液 | 50 | 50 | 50 |
3. 混匀后盖紧瓶盖（防止水分散失），置于沸水浴中保温5min，自来水冷却10秒钟后加入120μL 60%乙醇反复颠倒EP管数次，每管取出150μL加入96孔板或微量玻璃比色皿对应的孔中，于570nm测定吸光值，记为A空白、A标准、A测定，计算ΔA测=A测定-A空白、ΔA标=A标准-A空白（空白管只需做1 管），显色后务必在30min内测完。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA测定小于0.001可适当加大样本量，如果A测定大于2.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应在570nm处无吸收峰，因此，570nm处测定结果不含这两种氨基酸的量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测代入标准曲线公式计算出y(μmol/mL)。
2. 样本氨基酸含量计算
（1）按样本质量计算
氨基酸含量(μmol/g 质量)=y÷W×n
（2）按蛋白浓度计算
氨基酸含量(μmol/mg prot)=y÷Cpr×n
（3）按细菌或细胞数量计算
氨基酸含量(μmol/104 cells)=y÷细胞数量×n=y÷500×n=0.002×y×n
（4）按液体体积计算
氨基酸含量(μmol/mL)=y×2×n
W：样本质量，g；n：样本的稀释倍数；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；500：细菌或细胞总数，500万个；2：提取液体时的稀释倍数， (0.5 mL+0.5 mL)/0.5 mL =2。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
