产品简介
谷草转氨酶又叫天门冬氨酸氨基转移酶（EC 2.6.1.1），GOT广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化可逆转氨基反应，是氨基酸代谢的重要酶。此外，GOT在心肌细胞中含量最高，临床上一般常作为心肌梗塞和心肌炎的辅助检查。肝脏损害时其血清浓度也可升高。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本中GOT的活性水平。其原理是GOT催化α-酮戊二酸和天门冬氨酸发生转氨基反应，生成谷氨酸和草酰乙酸，草酰乙酸进一步自行脱羧生成丙酮酸；加入2,4-二硝基苯肼溶液，不仅终止上述反应，而且与酮酸中的羰基加成，生成丙酮酸苯腙；苯腙在碱性条件下呈红棕色，可以在505nm读取吸光值并计算GOT酶活力。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 1.5mL | 3mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1.5mL | 3mL | 4℃避光保存 |
试剂三 | 15mL | 30mL | 4℃保存 |
标准品（10µmol/mL丙酮酸） | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测505nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前预冷；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
标准曲线设置：按下表所示用去离子水将10µmol/mL标准溶液稀释至1.5、1、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 µmol/mL的标准液。
10µmol/mL标准品体积 | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（µmol/mL） | |
Std.1 | 60µL | 340 | 1.5 |
Std.2 | 40µL | 360 | 1 |
Std.3 | 32µL | 368 | 0.8 |
Std.4 | 16µL | 384 | 0.4 |
Std.5 | 8µL | 392 | 0.2 |
Std.6 | 4µL | 396 | 0.1 |
Std.7 | 2µL | 398 | 0.05 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4h之内使用。
样本制备
组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）样品：直接测定。
推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1.酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长至505nm，去离子水调零。
2.取25uL代测样本至EP管中煮沸10min作为对照管。
3.在EP管中加入下列试剂：
试剂名称 | 测定（μL） | 对照（μL） | 标准（μL） | 空白（μL） |
待测样本 | 25 | 0 | 0 | 0 |
煮沸10min 的待测样本 | 0 | 25 | 0 | 0 |
试剂一 | 25 | 25 | 25 | 25 |
去离子水 | 0 | 0 | 0 | 25 |
标准品 | 0 | 0 | 25 | 0 |
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应30min | ||||
试剂二 | 25 | 25 | 25 | 25 |
混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应20min | ||||
试剂三 | 240 | 240 | 240 | 240 |
反复吹打混匀，常温放置10min，4000g 25℃离心10min，吸取200μL反应液于96孔板或微量比色皿中，在505nm波长处测定各孔的吸光值A。计算相对吸光值ΔA测=A测定-A对照、ΔA标=A标准-A空白。（空白孔和标准曲线只需做一次）
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.001可适当加大提取样本量。如果ΔA测大于1.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制：
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测带入方程计算出y（µmol/mL）。
2. 样本GOT活性计算
（1）按样本鲜重计算：
单位定义：每g样本在反应体系中每小时催化产生1µmol丙酮酸为一个活力单位。
GOT(U/g 鲜重)=y×V反总÷(W×V样÷V提取)÷T=4y÷W
（2）按细菌或细胞数量计算：
单位定义：每104个细菌或细胞在反应体系中每小时催化产生1µmol丙酮酸为一个活力单位。
GOT(U/104 Cells)=y×V反总÷(500×V样÷V提取)÷T=0.008y
（3）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每小时催化产生1µmol丙酮酸为一个活力单位。
GOT(U/mg prot)=y×V反总÷(Cpr×V样)÷T=4y÷Cpr
（4）按液体样本体积计算
活性单位定义：每mL液体样品在反应体系中每小时催化产生1µmol丙酮酸为一个活力单位。
GOT(U/mL)=y×V反总÷V样÷T=4y
V反总：反应体系总体积，0.05mL；V样：样本体积，0.025mL；V提取：提取液体积，1mL； W：样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间,0.5h；500：细胞数量，500万个。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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