产品简介
脯氨酸(PRO)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内PRO含量显著增加。PRO增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测各种生物样本中PRO含量。其原理是用磺基水杨酸（SA）提取脯氨酸(PRO)，加热处理后，脯氨酸(PRO)与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在520nm测定吸光度。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48 T | 96 T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
反应缓冲液 | 6mL | 12mL | 4℃保存 |
6mL | 12mL | 4℃避光保存 | |
脯氨酸标准品 | 10mg | 10mg | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测520nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
离心机、制冰机
去离子水、甲苯
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
显色物：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
脯氨酸标准品：临用前在10mg的脯氨酸标准品中加入1mL去离子水，充分溶解，获得10mg/mL标准液，4℃避光保存。溶解后用不完的试剂，可4℃保存3天或分装-20℃长期保存。
标准曲线设置：取10µL 10mg/mL脯氨酸标准品用990µL去离子水稀释至100µg/mL。然后按下表所示，用去离子水进一步稀释标准液：
100 µg/mL标准液体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 浓度（µg/mL） | |
Std.1 | 160 | 40 | 80 |
Std.2 | 80 | 120 | 40 |
Std.3 | 40 | 160 | 20 |
Std.4 | 20 | 180 | 10 |
Std.5 | 8 | 192 | 4 |
Std.6 | 4 | 196 | 2 |
Std.7 | 2 | 198 | 1 |
Std.8 | 1 | 199 | 0.5 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
植物或动物组织样本：称取约0.1g组织，加入1mL 提取液，冰浴匀浆；之后置沸水浴提取10min，10,000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。
细菌或细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），之后置沸水浴振荡提取10min；10,000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。
血清（浆）样本：取0.1mL 血清（浆），加提取液 0.9mL，充分混匀，之后置沸水浴振荡提取10min，10,000g，常温离心10min，取上清，冷却后待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到520nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 操作表：
标准管（µL） | 空白管（µL） | 测定管（µL） | |
样本 | 0 | 0 | 100 |
标准品 | 100 | 0 | 0 |
去离子水 | 0 | 100 | 0 |
反应缓冲液 | 100 | 100 | 100 |
100 | 100 | 100 | |
将以上溶剂按顺序加入有盖EP管中，混匀，沸水浴30min（盖紧，防止水分散失），每10min振荡一次，冷却至室温。 | |||
甲苯 | 200 | 200 | 200 |
振荡30s，静置片刻；吸取100µL上层溶液于96孔板或微量玻璃比色皿中，于520nm 处测定吸光值，记录吸光值A。计算ΔA测定=A测定-A空白，ΔA标准=A标准-A空白（空白管只需测定一次）。 | |||
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测定小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测定大于1.5，需要将样本用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。
结果计算
1．标准曲线的绘制：
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标准为x轴，绘制标准曲线。
2．脯氨酸（Pro）含量计算：
根据标准曲线，将ΔA测定带入公式中（x）计算样品浓度 y（µg/mL）。
（1）按样本鲜重计算
Pro (µg/g 鲜重)=y×V样÷(W×V样÷V样总)=y÷W
（2）按细胞数量计算
Pro (μg/104 cells)=y×V样÷(500×V样÷V样总)=y÷500=0.002y
（3）按液体样本的体积计算
Pro (µg/mL)=y×10=10y
V样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1mL；V 样总：提取体系体积，1mL；W：样本鲜重，g；500：细胞数量，5×106；10：提取液体时的稀释倍数，（0.1mL+0.9mL）/0.1mL=10。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
