产品简介
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。异常高浓度的乳酸与癌症，糖尿病和乳酸酸中毒等病理状况有关。本试剂盒提供了一种检测生物样品如动植物组织，血清或血浆，细胞，培养基和发酵培养基中L(+)-乳酸的便捷方法。在该试剂盒中，乳酸盐被乳酸脱氢酶氧化，产生与四唑盐WST-8染料相互作用的产物，形成与样本中的乳酸盐浓度成正比例的有色产物，最大吸收峰在450nm。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃ |
反应缓冲液 | 5mL | 10mL | 4℃ |
试剂一 | 50μL | 100μL | -20℃ |
试剂二 | 0.5mL | 1mL | -20℃ |
试剂三 | 300μL | 600μL | 4℃，避光保存 |
试剂四 | 60μL | 120μL | 4℃，避光保存 |
乳酸标准品 (100mM) | 50μL | 100μL | -20℃ |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测450nm处的吸光度）
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一: 使用时，用反应缓冲液进行 1:20稀释，整个实验过程中，冰上避光放置。现用现配，用多少配多少；保存于-20℃。
试剂二: 即用型；整个实验过程中，冰上放置；分装保存于-20℃。
试剂三: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；4℃，避光保存。
试剂四: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；4℃，避光保存。
工作液：每孔准备85µL工作液，现配现用：吸取61µL反应缓冲液，8µL试剂二, 5µL试剂三, 1µL试剂四和10μL稀释后的试剂一混合均匀。
乳酸标准品 (4mM)：100mM乳酸标准品分装保存于-20℃。取 100mM乳酸标准品用提取液1:25稀释，建议取20μL 100mM乳酸标准品，加480μL提取液稀释至4mM，混合均匀。
标准曲线设置：按下表所示，用提取液将4mM标准品稀释为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mM的标准溶液。
标准品体积（µL） | 提取液体积（µL） | 标准品浓度（mM） | |
Std.1 | 400µL 4mM | 0 | 4 |
Std.2 | 200µL of Std.1 | 200 | 2 |
Std.3 | 200µL of Std.2 | 200 | 1 |
Std.4 | 200µL of Std.3 | 200 | 0.5 |
Std.5 | 200µL of Std.4 | 200 | 0.25 |
Std.6 | 200µL of Std.5 | 200 | 0.125 |
Std.7 | 200µL of Std.6 | 200 | 0.0625 |
样本制备
动植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，12,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞：收集500万细胞到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后12,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清、血浆或其它生物学液体：可直接用来检测，或者如果有必要，建议将样本根据预实验结果用提取液稀释后再进行检测。
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。大多数样本含有内源性乳酸脱氢酶（LDH）可降解乳酸，制备好的样本应尽快检测，或通过10kDa MW 离心式过滤器（超滤管）过滤，取滤液，以去除所有蛋白质，然后-80℃保存。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到450nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 操作表（下述操作在96孔板或微量玻璃比色皿中操作）：
试剂（μL） | 空白孔 | 标准孔 | 测定孔 | 对照孔 |
样本 | 0 | 0 | 20 | 20 |
标准品 | 0 | 20 | 0 | 0 |
提取液 | 20 | 0 | 0 | 0 |
工作液 | 80 | 80 | 80 | 0 |
反应缓冲液 | 0 | 0 | 0 | 80 |
3. 混匀后，37℃避光孵育30min，测定450nm处吸光度，空白孔记为A空，标准孔记为A标，测定孔记为A测，对照孔记为A对。计算ΔA测=A测-A对，ΔA标=A标-A空（空白和标准曲线只需做1次）
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.01可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.0，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
2. 乳酸含量的计算
将样本的ΔA测代入方程得到y值（1mM=1μmol/mL）。
（1）按样本鲜重计算
乳酸含量（μmol/g 鲜重）=y×V样÷(W×V样÷V样总) ×n=y÷W×n
（2）按样本体积计算
乳酸含量（μmol/mL）=y×V样÷V样×n=y×n
（3）按细胞数目计算
乳酸含量（μmol/104 cells）=y×V样÷(细胞数量×V样÷V样总)×n=y÷500×n=0.002×y×n
V样：加入样本体积，0.05mL；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL；n：样本稀释倍数； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞数量，500万。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
