产品简介
NADH氧化酶（NOX, EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH氧化为NAD。该酶不仅参与NAD的再生，而且与免疫反应密切相关。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本中NADH氧化酶(NOX)的活性水平。其原理是NOX能够将NADH氧化为NAD，NADH的氧化与2,6二氯酚靛蓝（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP被还原为无色的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出NOX的活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48 T | 96 T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | -20℃保存 |
试剂二 | 12mL | 24mL | 4℃保存 |
试剂三 | 0.75mL | 1.5mL | 4℃保存 |
试剂四 | 12mL | 24mL | 4℃保存 |
试剂五 | 1 | 1 | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测600nm处的吸光度）及恒温箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
试剂四：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂五：临用前配制；用前96T试剂五瓶中加入5mL去离子水，48T试剂五瓶中加入2.5mL去离子水，未用完试剂分装-20℃保存，实验时冰上放置，避免反复冻融。
样本制备
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1．准确称取0.1g组织或收集5×106细胞，加入1mL试剂一和10μL试剂三，用匀浆器冰上匀浆。
2．将匀浆液，600g，4℃离心5min。
3．将上清液移至另一离心管中，11,000g，4℃离心10min。
4．(选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的NOX（此步可选做，可用于判断线粒体提取效果）。
5．第二次沉淀即为线粒体，在沉淀中加入200 µL 试剂二和2μL试剂三，充分重悬沉淀，用于NOX活性测定。
注意：样品处理等过程均需要在冰上进行，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存一个月。
实验步骤
1．酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到600nm，可见分光光度计去离子水调零。
2．试剂四置于25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）预热30min。
3．样本测定：在96孔板或微量比色皿中依次加入10μL样本，200μL 试剂四和40μL试剂五。
充分混匀，记录600nm处10s时吸光值A1，迅速放入25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）恒温箱中，准确反应 1min。迅速取出记录 1min 10s时的吸光度 A2。计算ΔA=A1-A2。
注意：1. 实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量；如果ΔA大于0.4，可用试剂二稀释样品，计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。
结果计算
NOX活力单位的计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。
NOX上清（U/g 鲜重）=ΔA上清÷0.005×V反总÷(V样÷V提取×W)÷T=5050×ΔA上清÷W
NOX沉淀（U/g 鲜重）=ΔA沉淀÷0.005×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=1010×ΔA沉淀÷W
NOX总（U/g 鲜重）=NOX上清+NOX沉淀=5050×ΔA上清÷W+1010×ΔA沉淀÷W
2. 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每104个细菌或细胞在反应体系中每分钟A600变化0.005定义为一个酶活力单位。
NOX上清（U/104 Cells）=ΔA上清÷0.005×V反总÷(V样÷V提取×500)÷T=10.1×ΔA上清
NOX沉淀（U/104 Cells）=ΔA沉淀÷0.005×V反总÷(V样÷V样总×500)÷T=2.02×ΔA沉淀
NOX总（U/104 Cells）=10.1×ΔA上清+2.02×ΔA沉淀
B. 使用微量玻璃比色皿测定的计算公式
1. 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX上清（U/g 鲜重）=ΔA上清÷0.01×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T=2525×ΔA上清÷W
NOX沉淀（U/g 鲜重）=ΔA沉淀÷0.01×V反总÷(W÷V样总×V样)÷T=505×ΔA沉淀÷W
NOX总（U/g 鲜重）=NOX上清+NOX沉淀=2525×ΔA上清÷W+505×ΔA沉淀÷W
2. 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每104个细菌或细胞在反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。
NOX上清（U/104 Cells）=ΔA上清÷0.01×V反总÷(V样÷V提取×500)÷T=5.05×ΔA上清
NOX沉淀（U/104 Cells）=ΔA÷0.01×V反总÷(V样÷V样总×500)÷T=1.01×ΔA沉淀
NOX总（U/104 Cells）=5.05×ΔA上清+1.01×ΔA沉淀
W：样本鲜重，0.1g；T：反应时间，1min；V反总：反应体系总体积，0.25mL； V样：加入样本体积，0.01mL；V提取：加入提取液体积，1.01mL；V样总：沉淀重悬体积，0.202mL； 500：细胞或细菌总数，5×106。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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