产品简介
细胞增殖的检测对于评估细胞健康,确定遗传毒性或评估抗癌药物至关重要。目前直接测量 DNA 合成是最准确的方法,在复制过程中将核苷类似物(例如[3H]胸苷或 5-溴-2'-脱氧尿苷)加入到细胞中,然后通过放射自显影或使用 BrdU 抗体来进行检测。EdU-488法细胞增殖成像分析试剂盒是一种替代 BrdU 的新型检测方法。EdU(5-乙炔基-2′-脱氧尿苷)是胸腺嘧啶核苷的核苷类似物,可以在 DNA 合成过程中替代胸苷掺入到新合成的 DNA 中。与 BrdU 方法相比 EdU-Click 检测不是基于抗体,因此不需要通过DNA 变性(变性通常使用氯化氢、加热或脱氧核糖核酸酶消化)来检测加入的核苷。检测基于 Click 反应,叠氮化物和炔烃之间由铜催化的共价反应,整个反应 30min 内可完成。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
100T | 500T | ||
EdU(10mM) | 100μL | 500μL | -20℃ |
洗液(5×) | 12mL | 60mL | -20℃ |
488染料 | 20μL | 100μL | -20℃,避光保存 |
反应缓冲液(10×) | 1mL | 5mL | 4℃ |
铜试剂 | 0.4mL | 2mL | 4℃ |
还原剂 | 100mg | 5×100mg | -20℃ |
DAPI (500×) | 24μL | 120μL | -20℃,避光保存 |
自备耗材
低温离心机
可调节式移液枪及枪头
去离子水
固定液(含 3.7%甲醛的 PBS)
通透剂(含 0.5%Triton X-100 的 PBS)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
EdU (10 mM):即用型;使用前,平衡到室温;-20℃保存。
洗液(1×):向洗液(5×)中添加磷酸盐缓冲液(PBS),将 5×母液稀释成 1×工作液(终浓度为
3% BSA),并混匀。使用后分装并保存在-20℃,该溶液可稳定保存 6个月。
488染料:即用型;使用前,平衡到室温;-20℃避光保存。
反应缓冲液(10×):即用型,使用前,平衡到室温;-20℃保存。
铜试剂:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
还原剂(10×)的配制:向还原剂中添加去离子水配制终浓度为 100mg/mL 的 还原剂(10×)并混合直至化合物完全溶解。使用后分装-20℃保存,该溶液可稳定保存 6 个月。若溶液变成棕色,说明组分已经降解,不建议继续使用。
DAPI (1×):临用前配制,用 PBS 按 1:500 的比例配成 1×DAPI 工作液;分装,-20℃避光保存。
实验步骤
A. EdU 标记培养细胞
本实验以 96 孔板培养的贴壁细胞为例。悬浮细胞可在孵育 EdU 后进行涂片处理(将适量细胞滴加到载玻片上,酒精灯烘烤至干燥),涂片后从固定开始与贴壁细胞采用相同的染色步骤。
1. 孔板内放入适配盖玻片,接种适量细胞,使其生长至所需密度后处理细胞;
2. 用 10mM EdU 溶液在培养基中制备 2×EdU 工作溶液(20µM)。推荐的 EdU 终浓度为 10µM,用细胞培养液 1:500 稀释 10mM EdU 即可得到 2×EdU 工作溶液(20µM);
3. 将预热(37℃)的2×EdU 溶液等体积添加到含有试验细胞的培养基中,使96孔板中的 EdU 终浓度变为 1×;
注意:建议不要更换所有培养基,因为这会影响细胞增殖速率;建议 EdU 起始浓度是10µM。
4. 在最适合的条件下孵育细胞 2 h(根据细胞扩增时间确定,一般肿瘤细胞的孵育时间为 2 h);
5. 孵育后除去培养基,并向每个孔中加入 0.1 mL 固定液(含 3.7%甲醛的 PBS),室温下孵育 15 min;
6. 除去固定液,用 0.1 mL洗液 (1×)浸洗孔中细胞 5 min,重复 3 次;
7. 除去洗涤液,向每个孔中加入 0.1 mL 通透剂(含 0.5%Triton X-100 的 PBS),室温下孵育 15 min;
8. 除去通透剂,用 0.1 mL洗液 (1×)浸洗孔中细胞 5 min,重复 2 次;
9. 转步骤 C。
B. EdU 标记活体动物
本实验以 6 周龄小鼠为例,其它动物体内 EdU 的标记请参考相关文献。
1. 对于小鼠,可以按照 10-200 mg/kg 的用量,把 EdU 用 PBS 配制成一定浓度,腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关,可以参考相关文献,因此初次使用时建议对 EdU 的使用浓度进行一定的摸索,或者直接使用 50mg/kg 的浓度进行测试。如果之前使用过 BrdU 进行实验,则可以参考 BrdU 的终浓度作为 EdU的终浓度。EdU 需单独购买;
2. 24小时后或根据特定实验确定的适当时间后,快速处死小鼠,取出所需的组织,按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时间也可以参考相关文献自行调整;
3. 对于冰冻切片:
(1) 加入适量固定液(含 3.7%甲醛的 PBS),室温下孵育 15min;
(2) 除去固定液,用适量洗液 (1×)浸洗 5min,重复 3 次;
(3) 除去洗涤液,加入适量通透剂(含 0.5%Triton X-100 的 PBS),室温孵育 15min;
(4) 除去通透剂,用适量洗液 (1×)浸洗 5min,重复2次;
(5) 抗原修复(选做):如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色,并有必要进行抗原修复,可以使用适当的抗原修复液,或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理;
(6) 转步骤 C。
4. 对于石蜡切片:
(1) 脱蜡:二甲苯中脱蜡 5-10min,换用新鲜的二甲苯,再脱蜡 5-10min。组织复性:在无水乙醇中洗涤 5 min,换新的无水乙醇洗涤 3min;然后依次在 95%、85%、75%和 50%乙醇中洗涤 3min;最后在 PBS 中洗涤 5min。
(2) 抗原修复(选做):如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色,并有必要进行抗原修复,可以使用适当的抗原修复液,或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理;
注意:如果使用蛋白酶 K 或胰酶进行抗原修复,必须反复洗涤干净,否则残留的酶会严重干扰后续标记反应。
(3) 转步骤 C。
C. EdU 检测
注意:在该步骤中,每孔使用100 µL反应混合物。对于其它孔板或切片,反应混合物体积可根据实际情况进行调节,但必须按比例加入反应组分。
1. 根据下表制备 Click-iT 反应混合物;
注意:要按表中列出的顺序添加成分,否则反应将无法得到最佳效果。配置好的 Click-iT 反应混合物必须在15min内使用。
组分 | 体积 |
去离子水 | 758μL |
反应缓冲液(10×) | 100μL |
铜试剂 | 40μL |
488染料 | 2μL |
还原剂(10×) | 100μL |
总体积 | 1mL |
2. 向每个样品中加入 100 µL Click-iT 反应混合物,室温下避光孵育30min;
3. 除去反应混合物,用 0.1 mL洗液 (1×)浸洗 5min,重复 3 次,除去洗涤液;
重要提示:在孵育过程中一定要避光。如不需要其它染色,孵育并洗涤后请直接进行成像和分析。可在荧光显微镜下观察,或者使用流式细胞仪(用500μl洗涤液重悬细胞后上机)、多功能酶标仪、高内涵筛选仪器(一般高内涵筛选需要细胞核复染)进行荧光检测分析。如果需要检测细胞增殖的比例,可以参照步骤4.对细胞核进行复染。
4. 可选步骤:进行核染色(1×DAPI)或抗体标记;
细胞核染色:(1)每孔加0.1mL的1×DAPI溶液,室温避光孵育10min。
(2)吸除1×DAPI溶液,用 0.1 mL洗液 (1×)浸洗 5min,重复 3 次。
5. 用荧光显微镜或其他荧光设备分析样品中标记的 DNA(Ex/Em = 501/525nm),用 Ex/Em = 360/460nm 检测细胞核。
注意事项
1. 为避免交叉污染,在加入不同样本和不同试剂时都需更换吸头。
2. 实验开始前确保所有的组分及设备处于合适的温度。
3. 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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