产品简介
研究细胞运动和定位，需要用到对活细胞无毒的专一性探针。活细胞示踪试剂盒提供了一种通用且保存良好的细胞示踪试剂（活细胞荧光示踪探针），用于监测细胞的移动，位置，增殖，迁移，趋化性和侵袭性。活细胞荧光示踪探针，可以通过被动扩散进入细胞，与细胞内蛋白共价结合，是一种长效细胞示踪染料。一旦进入细胞，非荧光性的活细胞荧光示踪探针会被胞内酯酶水解，产生绿色荧光（Ex/Em=494/521nm）。这些荧光产物只能积聚在具有完整细胞膜的细胞中，因此死细胞因无完整细胞膜不能被染色。活细胞荧光示踪探针对pH变化不敏感，可以由甲醛或戊二醛固定。活细胞荧光示踪探针可以在活细胞中保留好几代，并可以显示荧光至少一周。探针可被转移到子细胞，但是不转移到群体中的相邻细胞。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | ||
100T | 500T | 2000T | ||
活细胞荧光示踪探针 | 50μL | 250μL | 1mL | -20℃，避光保存 |
反应缓冲液（10×） | 5mL | 25mL | 100mL | 4℃ |
自备耗材
荧光显微镜或流式细胞仪、离心机
24孔板、可调节式移液枪及枪头
去离子水、PBS
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
活细胞荧光示踪探针：冰上操作，分装避光保存，避免反复冻融。
1×反应缓冲液：用去离子水把10×反应缓冲液 稀释到1×反应缓冲液。使用前预热到37℃。
染色溶液配制：实验开始之前，将活细胞荧光示踪探针以1：1000 的比例稀释到1×反应缓冲液中。相应地扩大剂量以进行大样本量测定。使用前避光并预热至37℃。
注意: 对于不同的细胞类型和/或实验条件，应根据经验确定活细胞荧光示踪探针的最终浓度。通常，长期染色（超过约3天）或使用快速分裂的细胞需要使染料浓度加倍。对于较短的实验（例如生存力测定），可能需要使用浓度低至1：5000 稀释的染料。为了维持正常的细胞生理状态并减少潜在的伪影，应将染料的浓度保持在尽可能低的水平。
实验步骤
A. 流式细胞仪定量
1. 用所需的方法处理细胞，并建立平行对照组；
注意：平行对照组建议：未染色的细胞（即不加活细胞荧光示踪探针的细胞），用1×反应缓冲液悬浮；
2. 对于非贴壁细胞，通过离心（4℃，300g，5min）收集 0.5-1×106个细胞。用预冷的PBS洗涤两次，并弃去PBS。对于贴壁细胞，首先使用胰蛋白酶（不含EDTA）消化细胞，然后离心；
3. 将细胞沉淀重悬于500uL 染色溶液中；
4. 黑暗条件下，37℃孵育细胞15-30min；
5. 以500g离心细胞，并弃去上清液；
6. 沉淀重悬在新鲜的预热培养基中，再孵育细胞30min，以确保与探针完全接触，并再次用PBS洗涤细胞；
7. 以5×105到1×106细胞/mL的密度将细胞沉淀重悬在预热的PBS中，并立即使用FL1通道（通常为 FL1），通过流式细胞仪分析细胞。
B. 荧光显微镜检测
1. 对于非贴壁细胞：按照步骤A.1 到步骤 A.7进行，将步骤 A.7的细胞悬液放在载玻片上，用玻璃盖玻片盖住细胞。尽快使用适当的滤光片通过荧光显微镜分析细胞。如果要固定和透化细胞，请继续执行步骤 B.3。
2. 对于贴壁细胞：建议的方案如下
（1）用24孔培养皿直接培养细胞。染色前，在 37℃的CO2培养箱中培养至少24h；
（2）用所需的方法处理细胞；
（3）用PBS洗涤细胞两次并弃去PBS；
（4）向细胞中加入0.5mL染色溶液，并在黑暗中于 37℃孵育15-30min；
（5）弃去上清液，换上预热的新鲜生长培养基，然后在黑暗中于37℃下再孵育30min；
（6）用PBS或适当的缓冲液洗涤细胞两次。 如果要固定和透化细胞，请继续进行步骤 B.3；
（7）使用合适的滤光片进行观察。
3. 固定和透化
（1）使用含醛的固定剂进行固定。通常，我们使用 3.7%甲醛在室温下将细胞固定15min；
（2）固定后，用PBS洗细胞3次；
（3）固定后，如果随后要用抗体检测细胞，应将其在冰冷的丙酮中孵育10min以使细胞通透，通透后，用 PBS洗细胞3次。
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