提取/检测试剂盒

Caspase-1 活性检测试剂盒 (比色法)

货号:PMK0994
规格:20T/50T/100T
价格:680元/1200元/2400元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)。Caspase 是一类蛋白酶家族,成员较多,该家族已显示在凋亡中起关键作用。哺乳动物caspases 可分为三个功能组:启动子半胱天冬酶(Caspase2、8、9 和 10),执行者半胱天冬酶(Caspase-3、6 和 7)和炎性半胱天冬酶(Caspase 1、4、5、11 和 12)。Caspase-1(ICE,白介素-1β-转换酶)负责将两种炎性细胞因子白介素 1β 和 IL-18 的蛋白水解成活性细胞因子,从而引发促炎反应。它还将加德敏DGastermin DGSDMD)裂解为活性形式,从而导致细胞凋亡。本试剂盒基于 Caspase 1 水解肽底物Ac-YVAD-pNA(乙酰基-Tyr-Val-Ala-Asp 对硝基苯胺),产生黄色的对硝基苯胺(pNA),pNA在405nm 附近有强吸收,从而可以通过测定吸光度来检测 Caspase 1 的活性。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

20T

50T

100T

细胞裂解

20mL

50mL

100mL

4℃

反应缓冲液(2×)

5mL

10mL

20mL

4℃

底物

140μL

350μL

700μL

-20℃,避光保存

pNA标准品(10mM)

100μL

250μL

500μL

-20℃,避光保存

DTT

300μL

750μL

1.5mL

-20℃

自备耗材

酶标仪(能测405nm 处的吸光度)

低温离心机、制冰机

96孔板、可调节式移液枪及枪头

去离子水、磷酸盐缓冲液 (PBS)

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。

细胞裂解液: 使用前1mL细胞裂解液加入10 µL DTT的比例加入DTT,置于冰上备用

反应缓冲液 (含 DTT): 使用前反应缓冲液(2×)加等体积去离子水稀释到反应缓冲液 (1×),再1mL反应缓冲液 (1×)加入10µL DTT的比例加入DTT,置于冰上备用

底物: 即用型;实验过程中置于冰上;–20℃保存。用不完的试剂-20℃避光分装保存,避免反复冻融。

DTT : 即用型;实验过程中置于冰上;–20℃保存。用不完的试剂-20℃分装保存,避免反复冻融。

标准曲线设置20µL pNA标准品 (10mM)180µL 反应缓冲液 (含 DTT)稀释至1000µM pNA标准品。用1000µM pNA按下表所示,进行下一步稀释:


标准品体积

反应缓冲液 (含DTT)体积µL)

浓度 (µM)

Std.1

200µL of 1000µM pNA

0

1000

Std.2

100µL of Std.1(1000µM)

100

500

Std.3

100µL of Std.2 (500µM)

100

250

Std.4

100µL of Std.3 (250µM)

100

125 

Std.5

100µL of Std.4 (125µM)

100

62.5 

Std.6

100µL of Std.5 (62.5µM)

100

31.25

Std.7

100µL of Std.6 (31.25µM)

100

15.6

注意:每次实验,请使用新配制的标准品用不完的标准品-20℃避光分装保存,避免反复冻融

样本制备

1. 通过所需方法诱导细胞凋亡。同时,建议对每个样本设置不诱导的对照培养。

对于贴壁细胞,胰蛋白酶消化收集细胞。600g,4℃离心5min,小心吸去上清液。用1mL PBS洗涤细胞2次。离心后,去除上清液。1mL细胞裂解液中重悬 5×106个细胞。

对于悬浮细胞,600g,4℃离心5min,小心吸去上清液。用1mL PBS 洗涤细胞2次。离心后,去除上清液。在1mL细胞裂解液中重悬 5×106个细胞。

对于组织,将0.1g组织切成小块,用PBS清洗组织,加入1mL细胞裂解液,冰浴匀浆。

2. 裂解物冰上孵育 15-20min。

3. 16,000g,4℃离心15min,然后将上清液转移至新EP管中,置冰上待测。

4. 立即测定 Caspase 1 的酶活性或-80℃保存样品。同时可以取少量样品用 Bradford 法测定蛋白浓度。

注意:1. 推荐使用新鲜样品。如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存个月使用前,在冰上解冻

2. 在样品制备步骤中请勿使用蛋白酶抑制剂,可能会干扰测定。

3. 如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford 法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪预热 30min以上,调节波长到405nm。

2. 操作表(下述操作在96孔板中操作):

试剂

空白孔(μL)

标准孔(μL)

测定孔(μL)

反应缓冲液 (含 DTT)

100

50

50

不同浓度标准品

0

50

0

样本上清

0

0

50

底物

5

5

5

3. 混匀,37℃孵育 1-2h,检测 405nm 处吸光值。空白孔记为A,标准孔记为A、测定孔记为A。计算 ΔA=A-AΔA=A-A

注意:1.空白孔只需测定1次。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验;如果ΔA小于0.001可适当加大样本量,如果ΔA大于1.0,用细胞裂解液适当稀释样品后再进行测定,计算结果乘以稀释倍数。

2.在反应体系中,适当混匀,注意避免在混匀时产生气泡;3.发现颜色变化比较明显时即可测定405nm 的波长。如果颜色变化不明显,可以适当延长孵育时间,甚至可以孵育过夜。

结果计算

1. 标准曲线的绘制:

ΔA 标为x轴,标准溶液浓度为y轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。将样本的 ΔA带入方程得到y值(μM即nmol/mL)。

2. Caspase-1 活性的计算

1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:为当底物饱和时37℃环境下,每毫克蛋白在反应体系中小时剪切1nmol pNA 底物产生1nmol游离pNA 的酶定义1个酶活力单位。

Caspase 1 活性(U/mg prot)=y×V反总÷(V×Cpr)÷T=2.1×y÷Cpr÷T

2)按样本鲜重计算

活性单位定义:为当底物饱和时37℃环境下,每克样本在反应体系中小时剪切1nmol pNA 底物产生1nmol游离pNA 的酶定义1个酶活力单位。

Caspase 1 活性(U/g 鲜重)=y×V反总÷(W×V÷V样总)÷T=2.1×y÷W÷T

3)按细胞数量计算

活性单位定义:为当底物饱和时37℃环境下,每104个细胞在反应体系中小时剪切1nmol pNA 底物产生1nmol游离pNA 的酶定义1个酶活力单位。

Caspase 1 活性(U/104 cell)=y×V反总÷(细胞数量×V÷V样总)÷T=2.1×y÷细胞数量÷T

V反总:反应体系总体积,0.105mL;V:加入的样本体积,0.05mL;T:反应时间,h;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品鲜重,g;V样总:加入提取液的体积,1mL;细胞数量:以万为单位的细胞数量。

结果展示

典型标准曲线--以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

 

 image

Fig. pNA 的标准曲线


SIGNUP FOR OUR NEWSLETTER
Subscribe free newsletter to get latest products and discount information.

武汉普美克生物技术有限公司 © All Rights Reserved. 地址:武汉市东湖高新区自贸生物创新港B区N803-804

电话:400-0698-668  手机:  Email:bioprimacy@aliyun.com

鄂ICP备17001029号-1