产品简介
绝大多数正常细胞的分裂能力是有限的，在不能分裂后就进入衰老状态，此过程即为细胞衰老（cell senescence）。正常细胞经过有限次数的分裂后停止分裂，出现不可逆的生长停滞，此时细胞仍然是存活的，但是细胞形态和生理代谢活性发生明显变化，通常表现为细胞体积变大，与衰老相关的β-半乳糖苷酶为活化状态。β-半乳糖苷酶是细胞溶酶体内的水解酶，通常在pH 4.0时表现活性，但在衰老细胞内该酶在pH 6.0条件下表现活性，这被认为是细胞衰老的生物标记。本试剂盒是一种基于衰老时衰老相关β-半乳糖苷酶活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的试剂盒。其原理是以 X-Gal为底物，在 pH 6.0 条件下，衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化该底物生成深蓝色产物，表现为细胞胞质有蓝色沉积物，可以在光学显微镜下进行观察。本试剂盒适用于培养细胞和组织切片的衰老检测，但仅染色衰老细胞，不会染色衰老前的细胞(presenescent cells)、静止期细胞(quiescent cells)、永生细胞(immortal cells)或肿瘤细胞。按照每个样品染色液用量为1mL计算，本试剂盒可完成100个样品的染色。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 |
100T | ||
β-半乳糖苷酶染色固定液 | 100mL | 4℃ |
β-半乳糖苷酶染色液A | 100mL | 4℃ |
β-半乳糖苷酶染色液B | 1.2mL | 4℃ |
DMF（二甲基甲酰胺） | 5mL | 4℃ |
X-Gal（粉剂） | 100mg | -20℃ |
自备耗材
显微镜、无 CO2的37℃培养箱
6孔板、移液器及枪头、封口膜
聚丙烯管(15或50mL)、制备试剂和缓冲溶液的各种玻璃器皿
去离子水、甘油、PBS缓冲液（推荐PMK0031）
试剂准备
β-半乳糖苷酶染色固定液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
β-半乳糖苷酶染色液A：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
β-半乳糖苷酶染色液B：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
X-Gal（粉剂）：将100mg X-Gal粉末用5mL DMF（二甲基甲酰胺）充分溶解混匀，分装至1.5mL洁净离心管中，每管0.5mL，-20℃避光保存，避免反复冻融。3个月内有效。
染色工作液配制：按照下表比例配制β-半乳糖苷酶染色工作液。如果是6孔板培养的细胞，每孔需要1mL染色工作液，如果是12孔板，每孔需要0.5mL染色工作液。根据样本量配制染色液，避免浪费。
组分 | 体积 |
β-半乳糖苷酶染色液A | 940µL |
β-半乳糖苷酶染色液B | 10µL |
X-Gal溶液 | 50µL |
总体积 | 1mL |
注意：1. X-Gal溶液需室温完全解冻混匀后再使用。
2. 配制染色工作液时请选择聚丙烯（PP）或玻璃材质的耗材，不能用聚苯乙烯（PS）材质的耗材。在配制染色工作液前，需检查染色液A的pH值，如果不是6.0（可能因保存条件导致pH发生改变），需用HCl或NaOH调节pH至6.0再使用。
3. β-半乳糖苷酶染色液A和B需提前恢复至室温后再使用，配制好的染色工作液需充分混匀无沉淀方可使用。
4. 操作时请穿实验服，佩戴一次性手套。
实验步骤
1. 对于贴壁细胞
(1) 6孔板培养好的细胞（或细胞爬片），吸除细胞培养液，用PBS洗涤2次，加入1mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min。
(2) 弃去固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次2min。
(3) 用移液器将PBS 吸除干净，每孔加入1mL β-半乳糖苷酶染色工作液，置于无 CO2的37℃培养箱中孵育2h至过夜。
注意：衰老细胞β-半乳糖苷酶染色反应依赖于特定的pH条件，不能在CO2培养箱中进行孵育显色，否则会影响染色工作液的pH，导致染色失败。染色期间需及时观察显色情况，如果样本中β-半乳糖苷酶表达量较高，在数小时内即可完成染色。如果β-半乳糖苷酶表达量低，则需适当延长孵育时间，期间需用保鲜膜或封口膜密封6 孔板，防止液体蒸发影响染色结果。
(4) 普通光学显微镜下观察，阳性细胞显色后，去除染色工作液。如果需要复染细胞核，向孔板内加入少量核固红染色液（推荐PMK0269）覆盖细胞室温染色3min，去除染色液，用PBS清洗数次。
(5) 加入2mL PBS覆盖细胞，至此染色完成，此样本可于4℃保存1周。或者加入70%甘油覆盖细胞，4℃可保存较长时间。如果是细胞爬片，则可将爬片充分烤干，二甲苯透明后滴加中性树胶封片，可长期保存。
2. 对于冰冻切片
(1) 冰冻切片室温复温10min。以组化笔画圈，将组织圈出。
(2) 向组织上滴加适量β-半乳糖苷酶染色固定液，以完全覆盖住组织为宜，室温固定20min。
(3) 组织切片经PBS浸泡洗涤3次，每次5min。
(4) 将切片置于避光湿盒中，向组织上滴加适量β-半乳糖苷酶染色工作液，需完全覆盖住组织。湿盒放入无 CO2的37℃培养箱中孵育，每隔2h显微镜下观察显色情况，如果未见显色，则继续孵育，直到组织上衰老细胞显色。如果样本需过夜孵育，则需滴加足量的β-半乳糖苷酶染色工作液，防止染液蒸发干片。
(5) 待组织显色后，去除染色液，切片入PBS浸洗2次，去离子水浸洗2次。
(6)（可选）滴加核固红染色液（推荐PMK0269）染色3min，去离子水洗3次。
(7) 切片无水乙醇脱水2次，每次5min再经二甲苯透明5min，滴加中性树胶封片。
注意：组织切片的β-半乳糖苷酶染色，对于样本的前期准备要求较高，样本需-80℃保存，并尽快完成检测。因为β-半乳糖苷酶非常容易失活，样本保存不当或时间过久，都可能导致酶失活，则染色时没有阳性。
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