产品简介

线粒体是真核细胞产生能量的场所，具有双层膜结构，包括线粒体外膜以及折叠的内膜。在完整线粒体内膜上有一个电压梯度即膜电位，外正内负。线粒体跨膜电位破坏是细胞凋亡发生后最早发生的细胞内变化之一。本试剂盒可用于检测线粒体跨膜电位的变化，为鉴别正常细胞和凋亡细胞提供了一种简便的方法。原理是基于JC-1线粒体荧光探针，在线粒体膜电位较高时，JC-1线粒体荧光探针聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光（Ex/Em= 585/590）；在线粒体膜电位较低时，JC-1线粒体荧光探针不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1线粒体荧光探针为单体(monomer)，可以产生绿色荧光（Ex/Em= 510/527nm）。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。JC-1线粒体荧光探针可以作为多种细胞的线粒体膜电位指标，包括肌细胞和神经元，以及完整的组织或分离的线粒体。本试剂盒包含CCCP，它能使质子梯度解偶联，可作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。

产品内容

自备耗材

荧光显微镜或流式细胞仪

细胞培养板、可调节式移液枪及枪头

离心机、37℃，5% CO₂细胞培养箱

超纯水

试剂准备

JC-1 线粒体荧光探针(250×): 使用前，平衡到室温；避光放置；试剂分装-20℃保存避免反复冻融。

CCCP(50mM):现用现配，冰上放置。按1mL培养基加入1μL CCCP(50mM)充分混匀的比例，用培养基配制，其终浓度为50μM。

PBS(10×)：使用前，平衡到室温，若有晶体析出，可37℃加热溶解后使用。

染色液: 现用现配，避光放置。按4µL JC-1线粒体荧光探针(250×)加入900µL超纯水溶解，随后加入100µL PBS(10×)涡旋混匀的比例配制，根据样本数量计算需要配制的体积。

注意：1.小管试剂开盖前，请先低速离心。

2. 请勿把PBS(10×)全部配制成1×PBS，本试剂盒使用过程中需直接使用PBS(10×)。

3. JC-1 线粒体荧光探针在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。

4. 为得到比较理想的结果，可根据细胞类型和实际染色效果对JC-1 线粒体荧光探针在250-2500稀释倍数之间进行适当调整。对于24孔板，按推荐稀释倍数配制相关检测试剂，且每孔使用0.5mL染色液，此时本试剂盒的50T和100T分别可以检测50次和100次。

实验步骤 

A 用流式细胞仪进行检测

1.实验药物处理细胞，并设置阳性对照：阳性对照孔用 50μM CCCP处理细胞，在37℃，5% CO₂细胞培养箱中孵育5min。

注意:对于特定的细胞，CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。

2.配制1×PBS ：将PBS(10×)加入超纯水水稀释成1×PBS，根据样本数量计算需要配制的体积；4℃保存。

3.收集细胞：对于非贴壁细胞，300g离心5min收集1×10⁶个细胞，用1×PBS 清洗2次。对于贴壁细胞，先用胰蛋白酶消化细胞，然后300g离心5min 离心收集1×10⁶个细胞，用1×PBS 清洗2次。

注意:建议保留未染色对照细胞（即不带JC-1染色），细胞悬浮在1×PBS中，使处理过的和未处理的样品都能通过流式细胞仪。

4.弃去清洗细胞所用的1×PBS，每孔中加入0.5mL染色液悬浮细胞，37℃，5% CO₂细胞培养箱孵育15-30min。

注意：1）不同细胞染色时间不同。正式实验前，做预实验确定最佳孵育时间。2）选择细胞状态好进行染色，以获得最佳实验结果。

5. 37℃孵育结束后，400g，4℃离心 3-4min，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。

6. 加入1mL预冷的1×PBS重悬细胞，400g，4℃离心 3-4min，沉淀细胞，弃上清，重复洗涤1次。

7. 将细胞重悬于500μL室温的1×PBS 中，流式细胞仪立即分析细胞。在 FITC 通道（通常为 FL1），可检测到凋亡细胞中的JC-1单体，呈扩散绿色荧光。正常细胞中，JC-1 聚集体可在 PI 通道（通常为 FL2）中检测，呈点状红色荧光。

注意：染色后尽量在30-60min内完成上机检测。

B 用荧光显微镜检测

悬浮细胞，遵循流式细胞仪的方案 A1-7步骤，将步骤A7收集的细胞悬液放置于载玻片上，用盖玻片盖住细胞。选择合适的滤光片对细胞进行荧光显微镜分析。

对于贴壁细胞：建议的方案如下所示（以24孔板为例，其他培养器皿以此类推）：

1.24孔细胞培养皿中直接培养细胞。在 37℃ CO₂培养箱中，至少培养24h，然后进行处理；

2.实验药物处理细胞，并设置阳性对照：阳性对照孔用 50μM CCCP处理细胞，在37℃，5% CO₂细胞培养箱中孵育5min。

注意：对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。

3.配制1×PBS ：将PBS(10×)加入超纯水水稀释成1×PBS，根据样本数量计算需要配制的体积；4℃保存。

4.用1×PBS 清洗细胞2次，弃去1×PBS。

5.每孔中加入适当体积的染色溶液悬浮细胞，通常96孔板每孔加入0.1mL，24孔板每孔加入0.5mL，12孔板每孔加入1mL，6孔板每孔加入2mL。37℃，5% CO₂细胞培养箱孵育15-30min。

注意：1）不同细胞染色时间不同。正式实验前，做预实验确定最佳孵育时间。2）选择细胞状态好进行染色，以获得最佳实验结果。

6.37℃孵育结束后，吸除上清，用 1×PBS 洗涤2次。

7.加入500μL室温的 1×PBS，在荧光显微镜下观察细胞。

注意：酚红不干扰 JC-1 染色。染色后尽量在30min 内完成拍照，在检测前需冰浴保存。

JC-1 染色。

相关产品：

PMK0872 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(增强型)

PMK0988 Annexin V-fluor 488/PI细胞凋亡检测试剂盒

PMK0997 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）

PMK0998 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（红色荧光）