产品简介：

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA,造成细胞染色体 DNA的降解。这种降解非常特异并有规律，所产生不同长度的 DNA 片段约为180bp-200bp的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状Ladder图谱。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色荧光探针(SF488)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。488-dUTP 标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成DNA链断裂的细胞。TUNEL实验中，TdT酶催化dUTP掺入断裂的DNA链的3´-OH 末端。抗原标记dUTP(如digoxin-dUTP、生物素-dUTP)，因为它可以直接进行原位检测，是一种更快速、直接的检测手段。

产品内容

自备材料：

PBS 缓冲液(pH~7.4)；4%多聚甲醛；牛血清白蛋白 (BSA) 或正常的羊、牛血清；70%乙醇(自选)；脱蜡溶剂(石蜡切片样本)

操作步骤：

1.样品的准备：

a) 细胞样品的准备：

1) 可选：准备一份阴性对照样本（加入不含 TdT 酶的TUNEL 反应液）。

2) PBS 清洗细胞两次。

3) 细胞固定：加入适量 4% 多聚甲醛(pH 7.4)溶液，4℃ 放置 30 min 。

4) PBS 清洗细胞两次。

5)  通透细胞：加入冰上预冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 h。细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存一周。或者细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100  溶液通透，室温放置 20 min 。

6)  PBS 清洗细胞两次。

b) 石蜡组织切片的准备：

1）室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2 次，每次 5 min，以彻底脱掉石蜡。注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。

2）室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗 2 次，每次 5 min。

3）室温下，将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗 1 次，每次 5 min。

4）室温下，将切片浸没于纯水中漂洗 1 次，每次 3 min，再将切片浸没于 1×PBS 中漂洗 1 次，每次 3 min，用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。

5）用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。

6）按 1:100 的比例，将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀释，使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL 稀释好的Proteinase K 溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育 20 min。（Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。

注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min，4 µm 左右的片子可以用 10 min，但 30 µm 左右的可用 30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

7）PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。注：这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

c) 冰冻组织切片样品的准备：

1）将冰冻切片放置于室温的片架上，室温 20 min，晾干。

2）将载玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液（in PBS）中，室温固定 30 min。

3）PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min。

4）用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

5）按 1:100 的比例，将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀释，使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL 稀释好的 Proteinase K 溶液， 使溶液覆盖全部样本区域， 室温孵育 10 min。Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。

注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min，4 µm 左右的片子可以用 10 min，但 30 µm 左右的可用 30 min，需摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

6）PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

d）阳性处理(仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行TUNEL 反应步骤)

1）按1:10 的比例用ddH2O 将10 × DNase I Buffer 稀释成1 × DNase I Buffer 备用。

2）滴加 100 µL 1 × DNase I Buffer 到已通透的样本上，室温平衡 5 min。

3）用 1 × DNase I Buffer 以 1:100 稀释DNase I (2 U/uL)， 使其为终浓度 20 U/mL 的工作液。

4）轻轻吸掉多余液体，加入 100 uL 浓度为 20 U/mL DNase I工作液，室温孵育 10 min。

5）轻轻吸掉多余液体，PBS 清洗样品 2 次

2.配制TUNEL检测液：

1)预先配制 TUNEL 反应混合液：每个样本需要已加入 1 uL TdT 酶的 50 uLTUNEL 反应缓冲液。

2) 每个样本加入 100 uL TUNEL 平衡缓冲液，孵育 5 min。

3) 弃去平衡缓冲液，用滤纸小心吸去切片样本周围的多余液体，每个样本加入 50 uL TUNEL 反应混合液。

a)贴壁细胞，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光孵育 60 min。

b) 悬浮细胞，可加入微孔板中，采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15 min 温和的震荡反应管，使之充分反应。37℃避光孵育 60 min。

c)组织样本，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育 2 小时，湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育 2 h。

4) 去掉反应液，在 1×PBS  的染色缸中浸泡润洗 2 次，每次5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100， 其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本 3  次，每次 5 min， 以降低背景。

5) （可选）复染：每个样本滴加浓度为 2 ug/mL 的 DAPI 染液，避光室温孵育 10 min。染色完后，轻轻去掉染液，并将样本在 1×PBS 中浸泡润洗 3 次，每次 5 min。

6)（可选）封片：将切片样本先纯水浸没 5 min，再放入70%乙醇浸没 5 min，再 80%乙醇浸没 5 min，90%乙醇浸没5 min，95%乙醇浸没 5 min，无水乙醇浸没 5 min，最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理 2次，每次 5 min。（通风厨中操作）。脱水完成后，擦去切片周围的液体，每个切片样本滴加 50 uL 抗荧光淬灭封片液， 盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。

7) 用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析，TUNEL Reaction Buffer是一种绿色荧光染料，激发波长、发射波长分别为 485 nm，515 nm(凋亡细胞应被标记上明亮的绿色荧光，没有加入 TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光)。

注意事项：

1)   荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2)   TUNEL Equilibration Buffer 和 TUNEL Reaction Buffer 中含有 Sodium cacodylate trihydrate 和Cobaltous chloride，使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤后， 请立即有大量水冲洗，废液请按有毒物质处理。

3)  本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

4)  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。