产品简介:
细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA,造成细胞染色体 DNA的降解。这种降解非常特异并有规律,所产生不同长度的 DNA 片段约为180bp-200bp的整数倍,表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状Ladder图谱。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色荧光探针(SF488)标记的dUTP(fluorescein-dUTP),这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。488-dUTP 标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞,而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成DNA链断裂的细胞。TUNEL实验中,TdT酶催化dUTP掺入断裂的DNA链的3´-OH 末端。抗原标记dUTP(如digoxin-dUTP、生物素-dUTP),因为它可以直接进行原位检测,是一种更快速、直接的检测手段。
产品内容
产品组分 | 20T | 50T | 100T | 保存条件 |
TUNEL Equilibration Buffer | 2*1ml | 5ml | 10ml | -20℃避光 |
TUNEL Reaction Buffer | 1ml | 2*1.5ml | 6ml | -20℃避光 |
TdT Enzyme | 20ul | 50ul | 100ul | -20℃ |
Proteinase K (2 mg/mL) | 40ul | 100ul | 200ul | -20℃ |
DNase I (2 U/μL) | 5ul | 13ul | 26ul | -20℃ |
10 × DNase I Buffer | 100ul | 260ul | 500ul | -20℃ |
自备材料:
PBS 缓冲液(pH~7.4);4%多聚甲醛;牛血清白蛋白 (BSA) 或正常的羊、牛血清;70%乙醇(自选);脱蜡溶剂(石蜡切片样本)
操作步骤:
1.样品的准备:
a) 细胞样品的准备:
1) 可选:准备一份阴性对照样本(加入不含 TdT 酶的TUNEL 反应液)。
2) PBS 清洗细胞两次。
3) 细胞固定:加入适量 4% 多聚甲醛(pH 7.4)溶液,4℃ 放置 30 min 。
4) PBS 清洗细胞两次。
5) 通透细胞:加入冰上预冷的 70%乙醇,在-20℃孵育 4 h。细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存一周。或者细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,室温放置 20 min 。
6) PBS 清洗细胞两次。
b) 石蜡组织切片的准备:
1)室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2 次,每次 5 min,以彻底脱掉石蜡。注:二甲苯有毒,易挥发,请在通风橱中进行此操作。
2)室温下,将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗 2 次,每次 5 min。
3)室温下,将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇(95%、90%、80%、70%)中,每种浓度各漂洗 1 次,每次 5 min。
4)室温下,将切片浸没于纯水中漂洗 1 次,每次 3 min,再将切片浸没于 1×PBS 中漂洗 1 次,每次 3 min,用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。
5)用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓,以便下游通透与标记。
6)按 1:100 的比例,将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀释,使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL 稀释好的Proteinase K 溶液,使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育 20 min。(Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。
注:蛋白酶 K 可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min,4 µm 左右的片子可以用 10 min,但 30 µm 左右的可用 30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。
7)PBS 浸润清洗切片两次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。注:这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净,否则会严重干扰后续的标记反应。
c) 冰冻组织切片样品的准备:
1)将冰冻切片放置于室温的片架上,室温 20 min,晾干。
2)将载玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液(in PBS)中,室温固定 30 min。
3)PBS 浸润清洗切片两次,每次 5 min。
4)用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。
5)按 1:100 的比例,将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀释,使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL 稀释好的 Proteinase K 溶液, 使溶液覆盖全部样本区域, 室温孵育 10 min。Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。
注:蛋白酶 K 可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min,4 µm 左右的片子可以用 10 min,但 30 µm 左右的可用 30 min,需摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。
6)PBS 浸润清洗切片两次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
d)阳性处理(仅阳性对照进行此步骤,其他样品直接进行TUNEL 反应步骤)
1)按1:10 的比例用ddH2O 将10 × DNase I Buffer 稀释成1 × DNase I Buffer 备用。
2)滴加 100 µL 1 × DNase I Buffer 到已通透的样本上,室温平衡 5 min。
3)用 1 × DNase I Buffer 以 1:100 稀释DNase I (2 U/uL), 使其为终浓度 20 U/mL 的工作液。
4)轻轻吸掉多余液体,加入 100 uL 浓度为 20 U/mL DNase I工作液,室温孵育 10 min。
5)轻轻吸掉多余液体,PBS 清洗样品 2 次
2.配制TUNEL检测液:
1)预先配制 TUNEL 反应混合液:每个样本需要已加入 1 uL TdT 酶的 50 uLTUNEL 反应缓冲液。
待测样品数量 | 1 | 5 | 10 |
TdT酶溶液(uL) | 1 | 5 | 10 |
TUNEL Reaction Buffer (uL) | 50 | 250 | 500 |
2) 每个样本加入 100 uL TUNEL 平衡缓冲液,孵育 5 min。
3) 弃去平衡缓冲液,用滤纸小心吸去切片样本周围的多余液体,每个样本加入 50 uL TUNEL 反应混合液。
a)贴壁细胞,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光孵育 60 min。
b) 悬浮细胞,可加入微孔板中,采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15 min 温和的震荡反应管,使之充分反应。37℃避光孵育 60 min。
c)组织样本,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内,37℃恒温箱孵育 2 小时,湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育 2 h。
4) 去掉反应液,在 1×PBS 的染色缸中浸泡润洗 2 次,每次5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100, 其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本 3 次,每次 5 min, 以降低背景。
5) (可选)复染:每个样本滴加浓度为 2 ug/mL 的 DAPI 染液,避光室温孵育 10 min。染色完后,轻轻去掉染液,并将样本在 1×PBS 中浸泡润洗 3 次,每次 5 min。
6)(可选)封片:将切片样本先纯水浸没 5 min,再放入70%乙醇浸没 5 min,再 80%乙醇浸没 5 min,90%乙醇浸没5 min,95%乙醇浸没 5 min,无水乙醇浸没 5 min,最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理 2次,每次 5 min。(通风厨中操作)。脱水完成后,擦去切片周围的液体,每个切片样本滴加 50 uL 抗荧光淬灭封片液, 盖上盖玻片,用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片,去除气泡以使封片完全。
7) 用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析,TUNEL Reaction Buffer是一种绿色荧光染料,激发波长、发射波长分别为 485 nm,515 nm(凋亡细胞应被标记上明亮的绿色荧光,没有加入 TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光)。
注意事项:
1) 荧光染料均存在淬灭问题,保存和使用过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
2) TUNEL Equilibration Buffer 和 TUNEL Reaction Buffer 中含有 Sodium cacodylate trihydrate 和Cobaltous chloride,使用时请佩戴口罩、手套,接触皮肤后, 请立即有大量水冲洗,废液请按有毒物质处理。
3) 本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
4) 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。