产品简介
细胞介导的细胞毒性是一种重要现象，其特征是免疫系统使受损的细胞在体内被细胞溶解。区分活细胞和死细胞对于研究生长控制和细胞死亡非常重要。活/死细胞双重染色试剂盒提供了一种方便的测定方法，以评估细胞的活力，它基于使用两种探针同时测定活细胞和死细胞的方法，这些探针测量公认的细胞健康参数：质膜完整性和细胞内酯酶活性。该试剂盒利用可渗透细胞的绿色荧光染料 Calcein AM（Ex/Em=488/530nm）染色活细胞，并使用不可渗透细胞的红色荧光染料 PI（Ex/Em=535/617）用来染死细胞。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | ||
500T | 1000T | 5*1000T | ||
Calcein AM | 55uL | 110uL | 510uL | -20℃，避光保存 |
PI | 55uL | 110uL | 510uL | -20℃，避光保存 |
反应缓冲液（10×） | 55mL | 110mL | 510mL | 4℃ |
自备耗材:
荧光显微镜或流式细胞仪或荧光酶标仪、离心机
细胞培养板、可调节式移液枪及枪头
去离子水、PBS
试剂准备:
Calcein AM: 冰上避光保存。
PI: 冰上避光保存。
反应缓冲液：使用前预热到 37℃。
染色溶液配制：按每1mL 反应缓冲液中加入1µL Calcein AM 和1µL PI的比例配制，根据使用样本的数量按比例放大实验。
注意：1. 各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
2. 为得到比较理想的结果，可根据细胞类型和实际染色效果对Calcein AM (1000×)和PI (1000×)在500-2000稀释倍数之间 进行适当调整。对于96孔板，按推荐稀释倍数配制相关检测试剂，且每孔使用100μl，此时本试剂盒的500T、1000T、5*1000T分别可以检 测500次、1000次和5000次。
3. 配制好的染色溶液必须一次使用完毕，不能冻存。也可以用其它合适的溶液，如无血清培养液、HBSS (C0218)或PBS (C0221A/C0221D)稀释Calcein AM (1000×)。
实验步骤:
A. 荧光显微镜检测
1. 接种培养：将细胞接种于96孔板等多孔板、细胞培养皿中或者细胞爬片上，按实验设计对细胞进行一定处理。
2. 洗涤：对于贴壁细胞，吸除培养液，用PBS洗涤细胞1遍；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5min，吸除上清， 用PBS洗涤1遍。
3. 染色：加入适当体积的染色溶液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入 500μl，6孔板每孔加入1ml。37ºC避光孵育30min。不同的细胞最佳孵育时间有所不同，以30min作为初始孵育时间，后续可以根据实际染色效果对染色时间进行适当调整和优化，以得到更加理想的染色效果。 4. 检测。孵育结束后，在荧光显微镜下观察染色效果(Calcein AM为绿色荧光，Ex/Em=494/517nm；PI为红色荧光， Ex/Em=535/617nm)。
B.流式细胞仪检测
1. 细胞准备：贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，并用PBS洗涤一次；悬浮细胞250-1000×g室温离心5min，弃上清，用PBS 洗涤一次。每个样品推荐的细胞用量为106个细胞。
2. 染色：对于106个细胞，加入1ml 染色溶液，重悬为单细胞悬液。37ºC避光孵育30min。
注意：需要准备好仅含缓冲液的细胞样品用作流式细胞仪检测时的阴性对照，该缓冲液与配制染色溶液的缓冲液宜保持一致。
4. 检测：孵育完成后，可以直接进行流式细胞仪检测(Calcein AM为绿色荧光，Ex/Em=494/517nm；PI为红色荧光， Ex/Em=535/617nm)。
注意：由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色 情况对Calcein AM或PI的稀释倍数进行适当调整。
C.荧光酶标仪检测细胞死活的变化
1.接种培养：将细胞接种于全黑96孔细胞培养板，每孔的细胞数需要控制在 100-10,000个，通常宜在2000-5000个范围内。按实验设计对细胞进行一定处理。
2.洗涤：对于贴壁细胞，吸除培养液，用PBS洗涤细胞1遍；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5min，吸除上清， 用PBS洗涤1遍。
3.染色：每孔加入100μl染色溶液。37ºC避光孵育30min。不同的细胞最佳孵育时间有所不同，以30min作为初始孵育时间，后续可以根据实际染色效果对染色时间进行适当调整和优化，以得到理想的染色效果。
4.检测：孵育结束后，用荧光酶标仪检测(Calcein AM为绿色荧光，Ex/Em=494/517nm；PI为红色荧光，Ex/ Em=535/617nm)。 通过对比RFU (Relative fluorescence values)，可以得出死细胞与活细胞数量的变化。
