产品简介
甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物,对所有生物都具有很高毒性。甲醛脱氢酶作为含锌中等链醇脱氢酶(ADH)的家庭成员之一,广泛存在于原核和真核生物中,该酶能利用NAD+作为辅酶,将有毒的甲醛氧化,是甲醛氧化途径中的关键酶。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本中甲醛脱氢酶(FDH)的活性水平。其原理是甲醛脱氢酶催化甲醛和NAD+产生NADH,在340nm处的吸光值会增加,测定340nm处的吸光值变化,可计算得到甲醛脱氢酶的活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48 T | 96 T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 7.5mL | 15mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃避光保存 |
试剂三 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
试剂四 | 0.75mL | 1.5mL | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)及恒温箱
96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
提取液:即用型;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:临用前48T加入3mL去离子水,96T加入6mL去离子水,溶解待用。用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂三:临用前48T加入0.75mL去离子水,96T加入1.5mL去离子水溶解待用。用不完的试剂可4℃保存一周,或分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂四:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
工作液:临用前按样本数量,每孔配制180µL工作液,现配现用。吸取110µL试剂一,50µL试剂二,10µL试剂三,10µL试剂四,充分混匀。
样本制备
组织样本:称取0.1g组织加入1mL提取液进行冰浴匀浆。匀浆液于4℃,10,000g离心20min。取上清,置于冰上待测。
细胞和细菌样本:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,低速600g离心5min,弃上清液,加入1mL提取液,冰浴超声波破碎5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后4℃,10,000g 离心10min,取上清,置冰上待测。
血浆、血清等液体样本样本:直接测定,根据预实验确定稀释倍数。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存一个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1.酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm,紫外分光光度计去离子水调零。
2.工作液置于37℃预热30min。
3.样本测定:在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入20μL样本,180μL工作液。充分混匀,立刻记录340nm处初始吸光值A1,37℃准确孵育5min,记录5min时的吸光度 A2。计算ΔA=A2-A1。
注意:1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量;如果ΔA大于0.5,可用提取液稀释样品,计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在37℃。
3. 因通过反应速率计算酶活,使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4-8个样本)。
结果计算
FDH酶活计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 按样本质量计算:
酶活定义:每克样品在反应体系中每分钟催化还原1nmolNAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH 酶活(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V提取)÷T=643×△A÷W
2. 按蛋白浓度计算:
酶活定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化还原1nmolNAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH 酶活(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=643×△A÷Cpr
3. 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每104个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH 酶活(U/104 Cells)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V提取)÷T=1.286×△A
4. 按液体体积计算:
单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟催化还原1nmol NAD+的酶量为1个酶活单位。
FDH 酶活(U/mL)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=643×△A
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;109:1 mol=109 nmol;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万个。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d:0.5cm 调整为 d:1cm 进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5.
勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。