产品简介
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）是很多氧化还原反应的辅酶，包括NADP+（氧化型）和NADPH（还原型）两种形式。NADP+也参与到生物合成反应中，比如脂质和核酸的合成。在动物细胞中，戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway，PPP）的氧化阶段是NADPH最主要的来源。NADP+/NADPH的测定主要应用于有关细胞或组织能量转化和氧化还原状态的研究中。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测细胞、组织和细菌样品中NADP+(氧化型辅酶II)和NADPH(还原型辅酶II)各自的量、比值和总量。其原理是分别用酸性和碱性提取液提取样品中NADP+和NADPH，基于葡萄糖脱氢酶循环反应（不识别NAD+/NADH），在这一反应过程中生成的NADPH将WST-8还原生成橙黄色的formazan（甲臜），在450nm左右检测有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中总的NADP+或NADPH的总量呈正比关系。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
反应缓冲液 | 5mL | 10mL | 4℃ |
试剂一 | 1mL | 2mL | 4℃ |
试剂二 | 300μL | 600μL | -20℃避光保存 |
试剂三 | 60µL | 120µL | -20℃避光保存 |
试剂四 | 60μL | 120μL | -20℃保存 |
NADPH标准品（10mM） | 100µL | 100µL | -20℃保存 |
NADP（酸性）提取液 | 50mL | 100mL | 4℃ |
NADPH（碱性）提取液 | 50mL | 100mL | 4℃ |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测450nm处的吸光度）
水浴锅、制冰机，低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿，可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
反应缓冲液: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装保存于-20℃。
试剂三: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装保存于-20℃。
试剂四: 即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；-20℃保存。
NADP（酸性）提取液: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
NADPH（碱性）提取液: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液配制：测定孔每孔配制85µL测定工作液，现配现用。吸取68µL反应缓冲液，1µL试剂四，5µL试剂二，1µL试剂三混合后，室温孵育5min，再加入10µL试剂一。
对照孔每孔配制85µL对照工作液：吸取79µL反应缓冲液，5µL试剂二，1µL试剂三。
NADPH标准曲线设置：把1µL 10mM的NADPH标准品用999µL反应缓冲液稀释至1mL 10µM NADPH标准品。按下表所示，进行下一步稀释:
10µM NADPH标准品体积(µL) | 反应缓冲液体积 (µL) | 浓度 (µM) | |
Std1. | 100 | 0 | 10 |
Std2. | 80 | 20 | 8 |
Std3. | 60 | 40 | 6 |
Std4. | 40 | 60 | 4 |
Std5. | 20 | 80 | 2 |
Std6. | 10 | 90 | 1 |
Std7. | 5 | 95 | 0.5 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品，NADPH标准品（10mM）分装保存于-20℃。
样本制备
组织中NADP和NADPH的提取：
NADP的提取：称取0.1g组织，加入1mL NADP（酸性）提取液，冰浴匀浆，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10,000g 4 ℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10,000g 4 ℃离心10min，取上清待测。
NADPH的提取：称取0.1g组织，加入1mL NADPH（碱性）提取液，冰浴匀浆，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10,000g 4℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10,000g 4 ℃离心10min，取上清待测。
细胞或细菌中NADP和NADPH的提取：
NADP的提取：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，低速600g离心5min，弃上清液，加入1mL NADP（酸性）提取液，冰浴超声波破碎5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10,,000g 4℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10,000g 4 ℃离心10min，取上清待测。
NADPH的提取：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，低速600g离心5min，弃上清液，加入1mL NADPH（碱性）提取液，冰浴超声波破碎5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10,000g 4℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10,000g 4℃离心10min，取上清待测。
血清（浆）中NADP和NADPH的提取
NADP的提取：吸取0.1mL血清（浆），加入0.9mLNADP（酸性）提取液，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10,000g 4℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL碱性提取液使之中和，混匀，10,000g 4℃离心10min，取上清待测。
NADPH的提取：吸取0.1mL血清（浆），加入0.9mLNADPH（碱性）提取液，95℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10,000g 4℃离心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混匀，10,000g 4℃离心10min，取上清待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到450nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：
试剂 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） |
反应缓冲液 | 40 | 0 | 0 | 0 |
不同浓度标准品 | 0 | 40 | 0 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 40 | 40 |
测定工作液 | 80 | 80 | 80 | 0 |
对照工作液 | 0 | 0 | 0 | 80 |
3. 充分混匀，室温孵育30min，测定450nm处的吸光值A。计算ΔA测=A测定-A对照、ΔA标=A标准-A空白。空白管只需做1管。
注意：1. 该分析基于酶催化的动力学反应，工作液的加入需要迅速，各组分需要彻底混合。
2. 为避免干扰实验，样本中应避免有如下物质存在：EDTA (>0.5 mM)，ascorbic acid, SDS (>0.2%)，sodium azide，NP-40 (>1%)及Tween-20 (>1%)。
3. 实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量，如果A测大于1.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准品浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测代入标准曲线来计算样本中NADP/NADPH的浓度y（µM即nmol/mL）。
2. 测定NADP/NADPH含量的计算公式
1）按样本质量计算：
NADP/NADPH (nmol/g) =(y×V样)÷(W×V样÷V样总)×n=y÷W×n
2）按细菌或细胞数量计算：
NADP/NADPH (nmol/104 Cells)=(y×V样)÷(细胞数量×V样÷V样总)×n=y÷500×n=0.002y×n
3）按液体体积计算：
NADP/NADPH (nmol/mL) =(y×V样)÷V样×10×n=10y×n
V样：加入样本体积，0.04 mL；V样总：提取体系总体积，1mL；W：样本质量，0.1g；500：细胞数量，500万；n：样本进一步稀释倍数；10：提取液体时的稀释倍数，（0.1mL+0.9mL）/0.1mL=10。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意：在这些浓度下，NADP和NADPH的标准曲线是相同的。此说明书中，我们仅提供NADPH标准曲线。
