产品简介
苹果酸酶（ME）广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高。ME催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和CO2，以及伴随NAD(P)+的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME活性与生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物ME活性测定较多，已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将ME分为NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。本试剂盒提供了一种简单、方便、快速的NAD-ME活性检测方法，其原理是NAD-ME催化NAD+还原成NADH, NADH在340nm处有特征吸收峰，在340nm下测定NADH增加速率可计算获得NAD-ME的活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂二 | 5mL | 10mL | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计（能测340nm处的吸光度）
96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机，低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液：临用前配制，对于48T，在试剂三中加入7.5mL试剂一和0.5mL去离子水；对于96T，在试剂三中加入15mL试剂一和1mL去离子水。充分混匀待用；未用完的试剂分装-20℃避光保存，避免反复冻融。
样本制备
动植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL提取液，超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。
血清（浆）等液体样本:直接测定，根据预实验确定稀释倍数。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm。分光光度计去离子水调零。
2. 工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴10min以上。
3. 在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10μL样本、55μL试剂二和160μL工作液，混匀后立即记录340nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
注意：1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可将反应时间延长到2分钟或5分钟，计算时调整公式中的时间；如果ΔA大于0.3，可用提取液稀释样品，计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本），不推荐同时测多个样本。
结果计算
A. 用96孔板测定的计算公式如下
1. 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（U/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=7235×ΔA÷W
2. 按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=14.469×ΔA
3. 按液体体积计算：
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（U/mL）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=7235×ΔA
4. 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
NAD-ME（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T= 7235×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
V反总：反应体系总体积，2.25×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数, 6.22×103 mol/L/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
B.使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
