产品简介
磷酸戊糖途径途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶（6PGDH）和 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6PGDH）依次催化 NADPH 合成，与能量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外，6PGDH 逆境生理中具有重要作用。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本中6PGDH活性，其原理是6PGDH 催化6-磷酸葡萄糖酸和NADP+生成NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰，而 NADP+没有；通过测定 340nm吸光度增加速率来计算6PGDH活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 9.5mL | 19mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃避光保存 |
试剂三 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液配制：临用前，将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
样本制备
组织：称取0.1g组织样本，加入1mL预冷的提取液，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞或细菌，离心后弃上清，加入1mL 预冷的提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）等液体样本：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月，样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒，进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外分光光度计去离子水调零。
2. 工作液置于25℃（普通物种）或者 37℃（哺乳动物）中预热30min。
3. 样本测定：在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10μL样本，190μL工作液，迅速混匀，于340nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，孵育3min以后再测定第190s吸光值记为A2。△A=A2-A1
注意：
1. 实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果△A小于0.001可适当加大样本量。如果△A大于0.5，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本）。
结果计算
A. 使用96孔UV微孔板测定的计算公式如下：
1. 按样本鲜重计算
活力单位定义：一定温度中，每g样品在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。
6PGDH（U/g 鲜重）=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=2143.6×ΔA÷W
2. 按液体体积计算
活性单位定义：一定温度中，每mL液体样本在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。6PGDH(U/mL)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=2143.6×ΔA
3. 按细胞数量计算
活力单位定义：一定温度中，每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。
6PGDH(U/104 Cells)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=2143.6×△A÷500=4.287×△A
（4）按蛋白浓度计算
活力单位定义：一定温度中，每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。
6PGDH(U/mg prot)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=2143.6×△A÷Cpr
ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4 L；109：1mol=1×109nmol；V样：加入反应体系中样本体积，10μL =0.01mL；V样总：提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白浓度mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，3min；500：细胞数量，500万。
B. 使用微量石英比色皿进行测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
