产品简介
磷酸戊糖途径途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6PGDH)和 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)依次催化 NADPH 合成,与能量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外,6PGDH 逆境生理中具有重要作用。本试剂盒提供了一种简单的检测方法,用于检测生物样本中6PGDH活性,其原理是6PGDH 催化6-磷酸葡萄糖酸和NADP+生成NADPH,NADPH在340nm有特征吸收峰,而 NADP+没有;通过测定 340nm吸光度增加速率来计算6PGDH活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 9.5mL | 19mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃避光保存 |
试剂三 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
提取液:即用型;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
工作液配制:临用前,将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
样本制备
组织:称取0.1g组织样本,加入1mL预冷的提取液,快速冰上匀浆。匀浆后的样本,8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞或细菌,离心后弃上清,加入1mL 预冷的提取液,冰浴超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
血清(浆)等液体样本:直接测定。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月,样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,匀浆液避免反复冻融。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒,进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm,紫外分光光度计去离子水调零。
2. 工作液置于25℃(普通物种)或者 37℃(哺乳动物)中预热30min。
3. 样本测定:在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10μL样本,190μL工作液,迅速混匀,于340nm处测定3min内吸光值变化,第10s吸光值记为A1,孵育3min以后再测定第190s吸光值记为A2。△A=A2-A1
注意:
1. 实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果△A小于0.001可适当加大样本量。如果△A大于0.5,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)。
3. 因通过反应速率计算酶活,使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4-8个样本)。
结果计算
A. 使用96孔UV微孔板测定的计算公式如下:
1. 按样本鲜重计算
活力单位定义:一定温度中,每g样品在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。
6PGDH(U/g 鲜重)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=2143.6×ΔA÷W
2. 按液体体积计算
活性单位定义:一定温度中,每mL液体样本在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。6PGDH(U/mL)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=2143.6×ΔA
3. 按细胞数量计算
活力单位定义:一定温度中,每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。
6PGDH(U/104 Cells)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=2143.6×△A÷500=4.287×△A
(4)按蛋白浓度计算
活力单位定义:一定温度中,每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。
6PGDH(U/mg prot)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=2143.6×△A÷Cpr
ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4 L;109:1mol=1×109nmol;V样:加入反应体系中样本体积,10μL =0.01mL;V样总:提取液体积,1mL;Cpr:上清液蛋白浓度mg/mL;W:样品质量,g;T:反应时间,3min;500:细胞数量,500万。
B. 使用微量石英比色皿进行测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d:0.5cm 调整为 d:1cm 进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。