辅酶2系列

6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH) 检测试剂盒

货号:PMK1017
规格:48T/96T
价格:900元/1500元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

磷酸戊糖途径途径中6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6PGDH)和 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)依次催化 NADPH 合成,与能量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外,6PGDH 逆境生理中具有重要作用。试剂盒提供了一种简单的检测方法,用于检测生物样本中6PGDH活性,其原理是6PGDH 催化6-磷酸葡萄糖酸和NADP+生成NADPH,NADPH在340nm有特征吸收峰,而 NADP+没有;通过测定 340nm吸光度增加速率计算6PGDH活性。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T

提取液

50mL

100mL

4℃保存

试剂一

9.5mL

19mL

4℃保存

试剂二

粉剂×1

粉剂×1

-20℃避光保存

试剂三

粉剂×1

粉剂×1

-20℃避光保存

自备耗材

酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)

96孔UV微孔或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

恒温箱、制冰机、低温离心机

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

提取液:即用型;4℃保存。

试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

工作液配制:临用前将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。

样本制备

组织:称取0.1g组织样本,加入1mL预冷的提取液,快速冰上匀浆。匀浆后的样本,8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。

细胞细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞或细菌,离心后弃上清,加入1mL 预冷的提取液,冰浴超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。

血清(浆)等液体样本直接测定。

注意推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,匀浆液避免反复冻融如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒,进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm,紫外分光光度计去离子水调零。

2. 工作液置于25℃(普通物种)或者 37℃(哺乳动物)中预热30min。

3. 样本测定:96孔UV板或微量石英比色皿依次加入10μL样本,190μL工作液,迅速混匀,于340nm处测定3min内吸光值变化,第10s吸光值记为A1孵育3min以后再测定190s吸光值记为A2△A=A2-A1

注意:

1. 实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果△A小于0.001可适当加大样本量。如果△A大于0.5,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。

2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)。

3. 因通过反应速率计算酶活,使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4-8个样本

 

结果计算

A. 使用96孔UV微孔板测定的计算公式如下:

1. 按样本鲜重计算

活力单位定义:一定温度中,每g样品在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。

6PGDHU/g 鲜重)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(V÷V样总×W)÷T=2143.6×ΔA÷W

2. 按液体体积计算

活性单位定义:一定温度中,mL液体样本在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。6PGDH(U/mL)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷V÷T=2143.6×ΔA

3. 按细胞数量计算

活力单位定义:一定温度中,每104个细胞或细菌在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。

6PGDH(U/104 Cells)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V÷V样总)÷T=2143.6×△A÷500=4.287×△A

4)按蛋白浓度计算

活力单位定义:一定温度中,每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化生成1nmol NADPH为1个酶活单位。

6PGDH(U/mg prot)=[△A×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V)÷T=2143.6×△A÷Cpr

ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V反总:反应体系总体积,200μL=2×10-4 L;1091mol=1×109nmol;V:加入反应体系中样本体积,10μL =0.01mL;V样总:提取液体积,1mL;Cpr:上清液蛋白浓度mg/mL;W:样品质量,g;T:反应时间,3min;500:细胞数量,500万。

B. 使用微量石英比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d:0.5cm 调整为 d:1cm 进行计算即可。

注意事项

1. 实验过程中请穿实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。

3. 试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。

5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。


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