产品简介
生物体内巯基主要包括谷胱甘肽巯基和蛋白质巯基。前者不仅能够修复氧化损伤的蛋白质，而且参与活性氧清除，后者对于维持蛋白质构象具有重要作用。通过测定总巯基含量和GSH含量，能够间接测定蛋白质巯基含量。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测各种生物样本中总巯基含量，其原理是巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412nm处有最大吸收峰。在一定的浓度范围内，总巯基含量与412nm吸光度成线性关系，根据标准曲线，即可计算出样品中总巯基含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
反应缓冲液 | 20mL | 40mL | 4℃保存 |
显色物 | 4mL | 8mL | 4℃避光保存 |
| 1 | 2 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测412nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机、去离子水、匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
显色物：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
标准品：含10mg还原型谷胱甘肽（GSH）/管，临用前加入1.3mL 蒸馏水，浓度为25µmoL/mL，4℃保存。
标准曲线设置： 按下表所示用蒸馏水将25µmoL/mL标准溶液用蒸馏水稀释至1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 µmoL/mL 的标准液。
标准品体积 | 蒸馏水体积（µL） | 标准品浓度（µmoL/mL） | |
Std.1 | 10 µL 25 µmoL/mL | 240 | 1 |
Std.2 | 100 µL of Std.1 (1 µmoL/mL) | 100 | 0.5 |
Std.3 | 100 µL of Std.2 (0.5 µmoL/mL) | 100 | 0.25 |
Std.4 | 100 µL of Std.3 (0.25 µmoL/mL) | 100 | 0.125 |
Std.5 | 100 µL of Std.4 (0.125 µmoL/mL) | 100 | 0.0625 |
Std.6 | 100 µL of Std.5 (0.0625 µmoL/mL) | 100 | 0.0313 |
Std.7 | 100 µL of Std.6 (0.0313 µmoL/mL) | 100 | 0.0156 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4h之内使用。
样本制备
组织：称取约 0.1g 样本，加入1mL 提取液，匀浆，8000g ，常温离心10min，取上清液待测。
血清（浆）、培养基等液体样本：直接测定。
细胞或细菌：收集500万细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；加入1mL 提取液超声波破碎细菌或细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）；8000g ，常温离心 10min，取上清液待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪预热30 min以上，调节波长到412nm;
2. 样本测定（在96孔板中依次加入下列试剂）：
试剂（µL） | 空白孔 | 标准孔 | 测定孔 | 对照孔 |
样本 | 0 | 0 | 40 | 40 |
提取液 | 40 | 0 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 40 | 0 | 0 |
反应缓冲液 | 120 | 120 | 120 | 160 |
显色物 | 40 | 40 | 40 | 0 |
混匀，室温10min，测定412nm吸光值。计算ΔA 测=A 测定-A 对照、ΔA 标=A 标准-A 空白。 （空白管只需做1管，设置对照孔是为了扣除样本本身的颜色，如果样本没有明显颜色就不用设置对照孔，ΔA测=A 测定-A 空白）
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于2.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测带入x计算出y（µmoL/mL）。
2. 样本总巯基含量计算
（1）按样本质量计算：
总巯基含量（µmoL/g质量）=y×V样÷（W×V样÷V样总）×n =y÷W×n
（2）按样本蛋白浓度计算：
总巯基含量（µmoL/mg prot）=y×V样÷（V样×Cpr）×n =y÷Cpr×n
（3）按血清、培养液体积计算：
总巯基含量（µmoL/mL）=y×V样÷V样×n=y×n
（4）按照细菌或细胞数量计算：
总巯基含量（µmoL/104 cell）=y×V样÷（细菌或细胞数量×V样÷V样总）×n =y÷细菌或细胞数量×n
V样总：加入提取液体积，1mL；V样：加入的样本体积，0.04mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度， mg/mL；细菌或细胞数量：以104为单位，万个；n：稀释倍数。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
