产品简介
亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，是亚硝态氮还原过程中的关键酶。NiR广泛存在于微生物及植物体内，在自然界氮素循环过程中发挥着重要作用，可以将亚硝酸盐降解为NO或 NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测NiR。其原理是亚硝酸盐（NO2—）能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰。亚硝酸还原酶可将NO2—还原为NO，使样本中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2-减少，即540nm处吸光值减少。通过测定540nm处的吸光值的变化可反映亚硝酸还原酶的活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 56mL | 112mL | 4℃保存 |
试剂一 | 2mL | 4mL | -20℃，避光保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 2.5mL | 5mL | 4℃保存 |
试剂四 | 5mL | 10mL | 4℃，避光保存 |
试剂五 | 5mL | 10mL | 4℃，避光保存 |
标准品（1M NaNO2） | 1mL | 1mL | -20℃，避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光值）以及恒温箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前平衡到室温；-20℃避光保存。
试剂二：临用前48T加2.5mL去离子水，96T加5mL去离子水溶解；4℃保存一个月或分装-20℃长期保存。
试剂三：即用型；使用前平衡到室温；4℃保存。如出现沉淀可以70-80℃加热溶解
试剂四：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光4℃保存。
试剂五：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光4℃保存。
工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。
标准品：含1M NaNO2，使用前平衡到室温；分装-20℃避光保存。
标准曲线设置：取10µL NaNO2 标准品（1M）用 990µL去离子水稀释至10mM NaNO2。取80µL 10mM 的NaNO2 用 920µL去离子水稀释至0.8mM NaNO2。用0.8mM NaNO2按下表所示，进行下一步稀释：
标准品体积 (µL) | 去离子水体积(μL) | 浓度 (mM) | |
Std.1 | 400µL 0.8mM NaNO2 | 0 | 0.8 |
Std.2 | 200µL of Std.1 | 200 | 0.4 |
Std.3 | 200µL of Std.2 | 200 | 0.2 |
Std.4 | 200µL of Std.3 | 200 | 0.1 |
Std.5 | 200µL of Std.4 | 200 | 0.05 |
Std.6 | 200µL of Std.5 | 200 | 0.025 |
Std.7 | 200µL of Std.6 | 200 | 0.0125 |
注意：标准品现配现用；稀释后的标准溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备
组织：称取0.1g样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆。10,000g，4℃离心10min，取上清，置冰上检测。
细菌或真菌：先收集500万细菌或真菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL预冷的提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后；10,000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2.样本测定（在EP管中操作）：
试剂名称 | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本（μL） | 20 | 20 | 0 | 0 |
标准液（μL） | 0 | 0 | 20 | 0 |
去离子水（μL） | 0 | 40 | 80 | 100 |
试剂一（μL） | 40 | 40 | 0 | 0 |
试剂二（μL） | 40 | 0 | 0 | 0 |
混匀后，25℃反应1h | ||||
试剂三（μL） | 40 | 40 | 0 | 0 |
去离子水（μL） | 0 | 0 | 40 | 40 |
充分震荡30S，10,000g，4℃，离心10min，取上清液加入96孔板或微量玻璃比色皿中 | ||||
上清液（μL） | 70 | 70 | 70 | 70 |
工作液（μL） | 140 | 140 | 140 | 140 |
充分混匀，37℃孵育30min后测定540nm处吸光值，计算ΔA测=A对照-A测定，ΔA标=A标准-A空白。每个测定管需设一个对照，标准曲线和空白只需要测一次。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.5，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将样本的ΔA测代入方程得到y值（1mM=1mmol/L=1μmol/mL）。
2. NiR活性计算：
（1）按样本鲜重计算：
单位定义：每g鲜重样品在反应体系中每小时催化产生1μmol NO2ˉ的量为一个活力单位U。
NiR（U/g 鲜重）=y×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=5y÷W
（2）按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每小时催化产生1μmol NO2ˉ的量为一个活力单位U。
NiR（U/mg prot）=y×V反总÷(V样×Cpr)÷T=5y÷Cpr
（3）按细菌数量计算：
单位定义：每104个细菌在反应体系中每小时催化产生1μmol NO2ˉ的量为一个活力单位U。
NiR（U/104 Cells）=y×V反总÷(V样÷V样总×500)÷T=0.01y
V反总：反应体系总体积，100μL=0.1mL；V样：加入样本体积：0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌数量，5×106。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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