产品简介
GOGAT 主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非绿色组织的前质体中，和谷氨酰胺合成酶（GS）共同构成 GS/GOGAT 循环，参与氨同化的调控。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中谷氨酸合成酶（GOGAT）活性。其原理是GOGAT以 NADH 为电子供体，催化谷氨酰胺的氨基转移到 α-酮戊二酸形成两分子的谷氨酸，NADH 在 340nm 吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测 340nm处的吸光值）及恒温培养箱
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型； 4℃保存。
试剂一：即用型；使用前平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前每瓶试剂二中加入9mL试剂一充分溶解混匀，现配现用（配好后3h内用完）。
样本制备
植物组织：称取约0.1g组织，加入1mL预冷的提取液，冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
细菌或真菌：先收集500万细菌或真菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL预冷的提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 试剂二置于25℃水浴5min。
3.样本测定：在96孔UV微孔板或微量石英比色皿中加入20μL样本和180μL试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测大于0.5，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
A. 用 96 孔板测定的计算公式如下：
1.按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GOGAT（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W
2.按细菌或真菌数量计算：
单位的定义：每1万个细菌或真菌在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GOGAT（nmol/min/104 Cells)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.286×ΔA
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；109：1 mol=109 nmol；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5min；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万个。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
