产品简介
一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一种极不稳定的生物自由基，分子小，结构简单，可快速透过生物膜扩散，作为一种新型的生物信使分子，在细胞间及细胞内传递信号，在机体的生理、病理过程中起着重要的作用。其广泛分布于生物体内神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统中，特别是神经组织中较丰富。NO易被氧化成亚硝酸盐和硝酸盐，因此，通常要测定亚硝酸盐和硝酸盐的总量来推算出总的一氧化氮的量。本试剂盒采用改进的格里斯法将硝酸盐还原为亚硝酸盐后，即可准确测定NO的生成量。格里斯分析的机理概括为重氮类之间的偶氮耦合，重氮类是由磺胺和 NO2-和 N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐产生的，产物在540nm处有特征吸收峰，测定其吸光值，可以计算NO含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃ |
试剂一 | 3mL | 6mL | 4℃，避光保存 |
试剂二 | 3mL | 6mL | 4℃，避光保存 |
试剂三 | 6mL | 12mL | 4℃，避光保存 |
试剂四 | 0.5mL | 1mL | 4℃，避光保存 |
标准品（1M NaNO2） | 1mL | 1mL | -20℃，避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测 540nm处的吸光值）及恒温培养箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型； 4℃保存。
试剂一：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光 4℃保存。
试剂二：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光 4℃保存。
试剂三：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光 4℃保存。
试剂四：即用型；使用前平衡到室温；实验过程中避光放置；避光 4℃保存。
工作液的配制：每孔需要200μL工作液，为避免损失，按204µL每孔体系配制：吸取104μL 试剂三，50μL 试剂一和50μL试剂二。工作液需现配现用。
标准曲线设置：取10µL NaNO2 标准品（1M）用 990µL 提取液稀释至10mM NaNO2。取10µL 10mM 的NaNO2 用 990µL 提取液稀释至100µM NaNO2。用100µM NaNO2按下表所示，进行下一步稀释：
100 µM NaNO2(μL) | 提取液(μL) | 浓度 (µM) | |
Std.1 | 200 | 0 | 100 |
Std.2 | 100 | 100 | 50 |
Std.3 | 40 | 160 | 20 |
Std.4 | 20 | 180 | 10 |
Std.5 | 10 | 190 | 5 |
Std.6 | 4 | 196 | 2 |
Std.7 | 2 | 198 | 1 |
Blank | 0 | 200 | 0 |
注意：标准品现配现用；稀释后的标准溶液不稳定，必须在4小时内使用。
样本制备
1. 动植物组织：称取约0.1g组织样本，加入1mL预冷的提取液，冰浴匀浆，14,000rpm，4℃离心10min，取上清液进行脱蛋白处理。
2. 细胞：收集500万细胞到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL预冷的提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后14,000rpm，4℃离心10min，取上清液进行脱蛋白处理。
3. 血清、血浆、尿液（和其他生物体液）：需要进行脱蛋白处理的样本进行脱蛋白处理以后用于检测，无需脱蛋白处理的样本直接检测。
脱蛋白处理：将150μL样品与8μL试剂四混合在1.5ml EP管中，旋涡，然后14,000rpm，4℃离心10min。将100μL的上清液转移到干净的EP管中，置冰上待测。
需要进行脱蛋白处理的样品包括血清、血浆、全血、含有FBS的细胞培养基、组织或细胞裂解物。尿液和唾液不需要脱蛋白。
注意：建议您使用新鲜样品，如果不立即实验，样品可在-80℃保存6个月。如果样品需要脱蛋白，则每个浓度标准品应制备150μL，并同样用试剂四处理，避免结果计算中需要使用稀释因子。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 将100μL稀释后的标准品和样本添加到单独标记的EP管中。然后在每个样本和标准管中加入200μL工作液，混合均匀。
3. 将反应体系37℃孵育30min。
4. 对反应管进行短暂离心以去除不溶物，并将每个反应体系中分别取200μL液体转移到96孔板或微量玻璃比色皿中。在540nm处读取吸光值。空白孔（标准品Blank）记为A空，标准孔记为A标，测定孔记为A测。计算ΔA测=A测-A空，ΔA标=A标-A空。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值大于1.4，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
2. NO含量的计算
将样本的ΔA测代入方程得到y值（1μM=1nmol/mL）。
（1）按样本鲜重计算
NO含量（nmol/g 鲜重）=y×V样÷(W×V样÷V样总)×n=y÷W×n
（2）按样本体积计算
NO含量（nmol/mL）=y×V样÷V样×n=y×n
（3）按细胞数目计算
NO含量（nmol/104 cells）=y×V样÷(细胞数量×V样÷V样总)×n=y÷500×n=0.002y×n
V样：加入样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；V样总：加入提取液体积，1mL；n：样本稀释倍数；500：细胞数量，500万。
换算：1 mg/dL NO相当于333μM，0.001%或10ppm。
注意：抗氧化剂和亲核剂（例如β-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇和半胱氨酸）可能会干扰检测。在样品制备过程中避免使用这些化合物。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
