产品简介
脲酶（UE）广泛分布于植物的种子中，也存在于动物的血液和尿液中，某些微生物也能分泌脲酶。UE能够水解尿素产生氨和碳酸，对尿素转化起关键作用。UE活性与有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关，反映了氮素状况。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法，用于检测各种生物样本中的脲酶活性，其原理是
利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N来反应UE活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 11mL | 22mL | 4℃保存 |
试剂三A液 | 0.2mL | 0.4mL | 4℃，避光保存 |
试剂三B液 | 0.8mL | 1.6mL | 4℃保存 |
试剂四 | 1mL | 2mL | 4℃保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测625nm处的吸光值）及恒温培养箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：小管试剂开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：临用前48T加入4.5mL去离子水，96T加入9mL去离子水，充分溶解待用，用不完的试剂 4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：临用前将A液倒入B液中混合，待用；用不完的试剂4℃保存一周。
试剂四：液体2mL×1瓶，4℃保存；
标准品：含100μg/mL氮标准液。
标准曲线设置：按下表所示用去离子水将100μg/mL标准品稀释为 100、50、25、12,5、6.25、3.125、1.56μg/mL的标准溶液。
标准品体积 | 去离子水体积（µL） | 浓度（μg/mL） | |
Std.1 | 400µL 100μg/mL | 0 | 100 |
Std.2 | 200µL of Std.1 (100μg/mL) | 200 | 50 |
Std.3 | 200µL of Std.2 (50μg/mL) | 200 | 25 |
Std.4 | 200µL of Std.3 (25μg/mL) | 200 | 12.5 |
Std.5 | 200µL of Std.4 (12.5μg/mL) | 200 | 6.25 |
Std.6 | 200µL of Std.5 (6.25μg/mL) | 200 | 3.125 |
Std.7 | 200µL of Std.6 (3.125μg/mL) | 200 | 1.56 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
组织：称取0.1g样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，转移到1.5mLEP管中。8,000g，4℃离心10min，取上清液于新离心管中，置冰上检测。
细菌：收集500万细菌到离心管内，用冷PBS清洗，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），转移到1.5mL EP管中。8,000g，4℃ 离心10min，取上清液于新离心管中，置冰上检测。
血清、血浆或尿样等液体样本：直接检测。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到625nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 酶促反应（在EP管中加入下列试剂）：
试剂名称 | 测定管（μL） | 对照管（μL） |
样本 | 20 | 20 |
试剂一 | 90 | 0 |
去离子水 | 0 | 90 |
试剂二 | 190 | 190 |
混匀，放入37℃孵育1h后，10,000g 25℃离心10min，取上清液。
3. 将上清液稀释10倍（取0.1mL上清液，加入0.9mL去离子水）。若最终计算得到的ΔA测仍大于1则继续稀释。
4. 测氨量（在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：
试剂名称 | 空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 测定孔（μL） | 对照孔（μL） |
稀释后的上清液 | 0 | 0 | 80 | 80 |
标准品 | 0 | 80 | 0 | 0 |
去离子水 | 80 | 0 | 0 | 0 |
试剂三 | 15 | 15 | 15 | 15 |
试剂四 | 15 | 15 | 15 | 15 |
充分混匀，室温放置20min | ||||
去离子水 | 90 | 90 | 90 | 90 |
充分混匀，在625nm处读取吸光值。空白孔记为A空，标准孔记为A标，测定孔记为A测，对照孔记为A对。计算ΔA测=A测-A对，ΔA标=A标-A空。每个测定需设一个对照，空白孔和标准曲线只需测定一次。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。ΔA测小于0.03可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以最终稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线绘制：
以标准溶液浓度（μg/mL）为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
将∆A测代入公式计算出样本浓度y（μg/mL）。
2. 样本S-UE活性计算
1）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位U。
UE活力（U/ g 鲜重）＝y×10×V反总÷(W× V样÷V样总)÷T =2.5y÷W
2）按液体样本体积计算：
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位U。
UE活力（U/mL）＝y×10×V反总÷V样÷T =2.5y
3）按细菌数量计算：
单位的定义：每1万个细菌在反应体系中每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位U。
UE活力（U/104 cell）＝y×10×V反总÷(500× V样÷V样总)÷T =0.005y
4）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1μg NH3-N定义为一个酶活力单位。
UE活力（U/mg prot）＝y×10×V反总÷(Cpr× V样)÷T =2.5y÷Cpr
10：样本处理时的稀释倍数； V反总：反应体系总体积：0.3mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，60min；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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