产品简介
HYP是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨和血管等，因此HYP含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，可检测各种生物样本中HYP含量，其原理是样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 自备 | 自备 | 室温保存 |
试剂一 | 4mL | 8mL | 4℃避光保存 |
试剂二 | 4mL | 8mL | 4℃避光保存 |
HYP标准品 | 0.5mL | 0.5mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测560nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
天平、低温离心机、烘箱
去离子水、无水乙醇、异丙醇、6mol/L盐酸、10mol/L NaOH溶液
玻璃管
试剂准备
注意：小管试剂开盖前，请先低速离心。
提取液：6mol/L盐酸，自备。浓盐酸：H2O（V/V）= 1:1，室温保存。
10mol/L NaOH: 按称40g NaOH，溶于少量水，加水定容至100mL的比例配制。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
HYP标准品：含0.5mg/mL HYP标准品，使用前，平衡到室温；4℃保存。
标准曲线设置：把0.5mg/mL（即500μg/mL） HYP标准品按下表所示，进行下一步稀释。
标准品体积 | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（μg/mL） | |
Std.1 | 64µL of 500μg/mL | 336 | 80 |
Std.2 | 200 µL of Std.1（80μg/mL） | 200 | 40 |
Std.3 | 200 µL of Std.2 (40μg/mL) | 200 | 20 |
Std.4 | 200 µL of Std.3 (20μg/mL) | 200 | 10 |
Std.5 | 200 µL of Std.4 (10μg/mL) | 200 | 5 |
Std.6 | 200 µL of Std.5 (5μg/mL) | 200 | 2.5 |
Std.7 | 200 µL of Std.6 (2.5μg/mL) | 200 | 1.25 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
组织：称取约 0.1g 样本于玻璃管，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入1mL的提取液，煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块（缠封口膜，防止爆盖），冷却后用10mol/L NaOH溶液（大约需要0.5mL）调节 pH 值至 6-8 范围内（不可过酸或过碱），再去离子水定容至2mL。最后12,000g，25℃，离心 20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），取上清待测。
细菌/细胞：取 5×106个细菌/细胞，加入1mL的提取液，煮沸或 110℃烘箱2至6小时消化至透明状（缠封口膜，防止爆盖），冷却后用10mol/L NaOH 溶液（大约需要0.5mL）调节pH值至6-8范围内（不可过酸或过碱），去离子水定容至2mL,12,000g，25℃，离心20min，取上清待测。
液体样本：取0.1mL 液体样本于玻璃管，加入0.9mL 的提取液（若测定数值过小可调整二者比例并使二者相加等于1.0mL，比如：0.3mL液体样本，加入0.7mL提取液；并调整结果计算中V液），煮沸或110℃烘箱2至6小时消化至没有可见大的团块（缠封口膜，防止爆盖），冷却后用10mol /L NaOH 溶液调节pH值至6-8范围内（不可过酸或过碱），再去离子水定容至2mL。最后12,000g，25℃，离心20min（若离心后仍有杂质，可通过过滤去除），取上清待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到560nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
试剂名称 | 空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） |
样本 | 0 | 0 | 60 |
不同浓度标准品 | 0 | 60 | 0 |
试剂一 | 60 | 60 | 60 |
混匀，室温静置20min | |||
试剂二 | 60 | 60 | 60 |
去离子水 | 180 | 120 | 120 |
混匀，60℃水浴20min（盖紧，以防止水分散失），取出后常温静置15min。取200μL至96孔板或微量石英比色皿中，于560nm测定吸光值，计算ΔA测=A测定-A空白、ΔA标=A标准-A空白（空白和标准曲线只需做1次）。显色后务必在30min内测完。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量，如果ΔA测大于2.0，样本可用去离子水进一步稀释，他乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将ΔA测带入标准曲线公式计算出y（μg/mL）。
2. 样本HYP含量计算
（1）按样本质量计算
HYP含量(μg/g质量)=y×V样本÷(W×V样本÷V样总)×n=2y÷W×n
（2）按细菌或细胞数量计算
HYP含量(μg/104 cell)=y×V样本÷(细胞数量×V样本÷V样总)×n=2y÷500×n=0.004y×n
（3）按液体体积计算
HYP含量(μg/mL)=y×V样本÷(V液×V样本÷V样总)=2y÷V液×n
V样本：加入样本体积：0.06mL；V样总：提取体系体积，2mL；W：样本质量，g；n：样本进一步稀释的稀释倍数；500：细菌或细胞总数，500万个；V液：液体样本体积，mL。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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