产品简介
乙酰胆碱酯酶（AchE）属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。本试剂盒提供了一种简便的检测方法可检测生物体内AchE活性，其原理是：AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412nm吸光度增加速率，计算AchE活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
反应缓冲液 | 8mL | 16mL | 4℃保存 |
显色物 | 0.65mL | 1.3mL | 4℃避光保存 |
底物 | 0.65mL | 1.3mL | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测412nm处的吸光度）
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
显色物：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
底物：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
工作液的配制：每孔配制180 µL工作液：吸取160 µL 反应缓冲液，10µL 显色物，10µL 底物。工作液需现配现用，根据需要测定的样本数按比例配制。
样本制备
1. 动物组织：称取约0.1g样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞：收集500万细胞到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
3. 新鲜血清（浆）等液体样本：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到412nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 恒温箱预热到37℃，工作液置于恒温箱中预热 30min。
3. 在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入20μL样本，180μL工作液，迅速混匀，37℃孵育3min（可使用酶标仪的温度设置功能，若酶标仪没有温度设置功能可以使用恒温箱），于412nm处测定3min内吸光值变化。第20s吸光值记为A1，第200s吸光值记为A2。ΔA =A2-A1。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.002可适当加大样本量。如果ΔA大于0.8，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 动物组织AchE活性
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE 酶活(U/mg prot)= (△A÷ε÷d×V反总×109)÷(Cpr×V样)÷T=490×ΔA÷Cpr×n
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE 酶活(U/g 鲜重)=(△A÷ε÷d×V反总×109)÷(W ×V样÷V样总)÷T=490×ΔA÷W×n
2. 细胞AchE活性
活性单位定义：每104个细胞在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。
AchE酶活(U/104 cells)=(△A÷ε÷d×V反总×109)÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=490×△A÷500=0.98×ΔA×n
3. 血清（浆）等液体样本AchE活性
活性单位定义：每毫升样本在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB 的酶量为1个酶活单位。
AchE 酶活(U /mL)=(△A÷ε÷d×V反总×109)÷V样÷T =490×ΔA×n
ε：TNB 摩尔消光系数，13.6×103L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积，L，200μL=2×10-4 L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；V样：加入上清液体积，0.02mL；T：反应时间，3min；n：样本稀释倍数；W：样品质量，g；V样总：提取液体积，1mL；500：细胞总数，500万。
B. 使用微量玻璃比色皿进行测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
