产品简介
碱性磷酸酶(AKP/ALP)是一种含锌的糖蛋白酶,在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。AKP/ALP广泛分布于人体各脏器中,以肝脏为主。本试剂盒提供了一种简单、快速的AKP/ALP检测方法,其检测原理是在碱性环境中,AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚;酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应生成红色亚醌衍生物,在510nm有特征光吸收;通过测定510nm吸光度增加速率,来计算AKP/ALP活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 2.5mL | 5mL | 4℃避光保存 |
试剂二 | 2.5mL | 5mL | 4℃避光保存 |
试剂三 | 7.5mL | 15mL | 4℃避光保存 |
标准品(2μmol/mL酚标准液) | 0.5mL | 0.5mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计(能测510nm处的吸光度)
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
标准品:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
样本制备
1. 组织样本:称取约0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,10,000 rpm,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
2. 细胞:收集500万细胞到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL 提取液,冰浴超声波破碎细胞5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后10,000 rpm,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
3. 血清(浆):血浆和血清可以直接用于测定。血浆制备时不能用EDTA和柠檬酸盐,可用其它抗凝剂。
4. 尿液:直接测定。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上,调节波长到510nm,可见光分光光度计去离子水调零。
2. 按照下表进行加样及反应:
空白孔(μL) | 标准孔(μL) | 对照孔(μL) | 测定孔(μL) | |
去离子水 | 4 | 0 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 4 | 0 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 0 | 4 |
试剂一 | 40 | 40 | 40 | 40 |
试剂二 | 40 | 40 | 40 | 40 |
混匀后置于37℃孵育15min | ||||
试剂三 | 120 | 120 | 120 | 120 |
样本 | 0 | 0 | 4 | 0 |
混匀后于510nm测定吸光度,其中标准和空白只需测定一次,每个样本均需设置对照,各孔的吸光度分别记为A空白,A标准,A对照,A测定,计算ΔA测=A测定-A对照、ΔA标=A标准-A空白。
注意:实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.0,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数,或减少提取用样本量。
结果计算
1. 按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃中每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。
AKP/ALP (U/mg prot)=(C标准品×ΔA测÷ΔA标×V反总)÷(Cpr×V样)÷T=6.8×ΔA测÷ΔA标÷Cpr
2. 按样本鲜重计算
活性单位定义:37℃中每克组织在反应体系中每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。
AKP/ALP(U/g鲜重)=(C标准品×ΔA测÷ΔA标×V反总)÷(W÷V提取×V样)÷T=6.8×ΔA测÷ΔA标÷W
3. 按液体体积计算
活性单位定义:37℃中每毫升血液或尿液在反应体系中每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。
AKP/ALP (U/mL)=(C标准品×ΔA测÷ΔA标×V反总)÷V样÷T =6.8×ΔA测÷ΔA标
4.按细胞数目计算
活性单位的定义:37℃中每1万个细胞在反应体系中每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。
AKP/ALP(U/104 cells)=(C标准品×ΔA测÷ΔA标×V反总)÷(细胞数量×V样÷V提取)÷T=6.8×ΔA测÷ΔA标÷500
C标准品:标准品的浓度,2μmol/mL;V反总:反应体系总体积,0.204mL; V样:加入反应体系中上清液体积,0.004mL;T:反应时间,15min;V提取:加入提取液体积,1mL; W:样本鲜重,g;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞数量,500万。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。