产品简介
碱性磷酸酶（AKP/ALP）是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。AKP/ALP广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。本试剂盒提供了一种简单、快速的AKP/ALP检测方法，其检测原理是在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应生成红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算AKP/ALP活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 2.5mL | 5mL | 4℃避光保存 |
试剂二 | 2.5mL | 5mL | 4℃避光保存 |
试剂三 | 7.5mL | 15mL | 4℃避光保存 |
标准品（2μmol/mL酚标准液） | 0.5mL | 0.5mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测510nm处的吸光度）
恒温箱、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
标准品：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
样本制备
1. 组织样本：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，10,000 rpm，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
2. 细胞：收集500万细胞到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后10,000 rpm，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
3. 血清（浆）：血浆和血清可以直接用于测定。血浆制备时不能用EDTA和柠檬酸盐，可用其它抗凝剂。
4. 尿液：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到510nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 按照下表进行加样及反应：
空白孔（μL） | 标准孔（μL） | 对照孔（μL） | 测定孔（μL） | |
去离子水 | 4 | 0 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 4 | 0 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 0 | 4 |
试剂一 | 40 | 40 | 40 | 40 |
试剂二 | 40 | 40 | 40 | 40 |
混匀后置于37℃孵育15min | ||||
试剂三 | 120 | 120 | 120 | 120 |
样本 | 0 | 0 | 4 | 0 |
混匀后于510nm测定吸光度，其中标准和空白只需测定一次，每个样本均需设置对照，各孔的吸光度分别记为A空白，A标准，A对照，A测定，计算ΔA测=A测定-A对照、ΔA标=A标准-A空白。
注意：实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.0，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白在反应体系中每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。
AKP/ALP (U/mg prot)=（C标准品×ΔA测÷ΔA标×V反总）÷(Cpr×V样)÷T=6.8×ΔA测÷ΔA标÷Cpr
2. 按样本鲜重计算
活性单位定义：37℃中每克组织在反应体系中每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。
AKP/ALP(U/g鲜重)=（C标准品×ΔA测÷ΔA标×V反总）÷(W÷V提取×V样)÷T=6.8×ΔA测÷ΔA标÷W
3. 按液体体积计算
活性单位定义：37℃中每毫升血液或尿液在反应体系中每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。
AKP/ALP (U/mL)=（C标准品×ΔA测÷ΔA标×V反总）÷V样÷T =6.8×ΔA测÷ΔA标
4.按细胞数目计算
活性单位的定义：37℃中每1万个细胞在反应体系中每分钟催化产生1μmol酚为一个酶活力单位。
AKP/ALP（U/104 cells）=（C标准品×ΔA测÷ΔA标×V反总）÷(细胞数量×V样÷V提取)÷T=6.8×ΔA测÷ΔA标÷500
C标准品：标准品的浓度，2μmol/mL；V反总：反应体系总体积，0.204mL； V样：加入反应体系中上清液体积，0.004mL；T：反应时间，15min；V提取：加入提取液体积，1mL； W：样本鲜重，g；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞数量，500万。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
