产品简介

动植物及微生物的细胞内外都存在明显的Na⁺、K⁺梯度差，细胞内是高K⁺低Na⁺，细胞外则是高Na⁺低K⁺，这显然是Na⁺、K⁺逆浓度梯度主动运输的结果，执行这种运输功能的体系称为Na⁺K⁺-离子泵，它利用水解ATP获取能量，推动K⁺吸收和Na⁺的排出，因此又叫Na⁺K⁺-ATP泵或Na⁺K⁺-ATP酶。Na⁺K⁺-ATP酶（Na⁺K⁺-ATPase）是一种广泛分布于机体内生物膜系统的酶，在细胞生理学中发挥多种功能，可催化ATP水解生成ADP和无机磷。本试剂盒提供了一种简单的检测方法检测生物样本中Na⁺K⁺-ATPase的活性水平。其原理是样本中存在的Na⁺K⁺-ATPase分解ATP生成ADP及无机磷，通过测定生成的无机磷的量可确定Na⁺K⁺-ATPase活性。

产品内容

自备耗材

酶标仪或可见光分光光度计（能测660nm处的吸光度）及水浴锅

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

制冰机、低温离心机

去离子水

匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

反应缓冲液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂一：临用前加6mL去离子水溶解；-20℃避光保存。

试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂三：临用前加3mL去离子水溶解；4℃避光保存。

试剂四：临用前加25mL去离子水溶解；4℃避光保存。

试剂五：临用前加25mL去离子水溶解；4℃避光保存。

试剂六：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

0.5μmol/mL标准磷应用液配制：将试剂七20倍稀释，如取0.1mL 试剂七加1.9mL去离子水充分混匀。

定磷剂的配制：按H₂O: 试剂四: 试剂五: 试剂六=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现配现用。

注意：试剂四、试剂五溶解后可在4℃保存一周。配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿避免磷污染。

样本制备

血浆、血清等液体样本：可直接检测。

动植物组织样本：按0.1g组织加入1mL 的提取液的比例进行冰浴匀浆。匀浆液于4℃，8,000g离心10 min。取上清，置于冰上待测。

细胞或细菌样本：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）；然后4℃，8,000g离心10min，取上清，置冰上待测。

注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。处理好的样本须当天检测。

如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1．酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长至660nm，可见光分光光度计去离子水调零。

2．酶促反应（在EP管中加入下列试剂）：

3．定磷（96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂）

4. 混匀，室温放置30min，在 660nm处，记录各管吸光值A，分别记为A_空白、A_标准、A_对照、A_测定。

注意：每个样本均需要做对照孔，空白孔和标准孔各做1个即可。实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果A_测定-A_对照小于0.001可适当加大样本量；如果A_测定-A_对照大于1.5或测定孔有明显浑浊，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。

结果计算

血清（浆）等液体样本Na⁺K⁺-ATPase活力的计算:

活性单位的定义：每小时每毫升液体样本中Na⁺K⁺-ATPase在反应体系中分解ATP产生1μmol无机磷的量定义为一个酶活力单位。

Na⁺K⁺-ATPase活力(U/mL)=C_标准×(A_测定-A_对照)÷(A_标准-A_空白)×V_反总÷V_样÷T=7.5×(A_测定-A_对照)÷(A_标准-A_空白)

2、组织、细菌或细胞中Na⁺K⁺-ATPase活力的计算：

（1）按蛋白浓度计算：

活性单位的定义：每小时每毫克组织蛋白中Na⁺K⁺-ATPase在反应体系中分解ATP产生1μmol无机磷的量定义为一个酶活力单位。

Na⁺K⁺-ATPase活力(U/mg prot)=C_标准×(A_测定-A_对照)÷(A_标准-A_空白)×V_反总÷(Cpr×V_样)÷T

=7.5×(A_测定-A_对照)÷(A_标准-A_空白)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

活性单位的定义：每小时每克组织中Na⁺K⁺-ATPase在反应体系中分解ATP产生1μmol无机磷的量定义为一个酶活力单位。

Na⁺K⁺-ATPase活力(U/g)=C_标准×(A_测定-A_对照)÷(A_标准-A_空白)×V_反总÷(V_样÷V_样总×W)÷T

=7.5×(A_测定-A_对照)÷(A_标准-A_空白)÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

活性单位的定义：每小时每1万个细菌或细胞中Na⁺K⁺-ATPase在反应体系中分解ATP产生1μmol无机磷的量定义为一个酶活力单位。

Na⁺K⁺-ATPase活力(U/10⁴ cells)=C_标准×(A_测定-A_对照)÷(A_标准-A_空白)×V_反总÷(V_样÷V_样总×500)÷T

=0.015×(A_测定-A_对照)÷(A_标准-A_空白)

C_标准：标准管浓度，0.5μmol/mL；V_反总：酶促反应总体积，0.25mL；V_样：加入样本体积，0.1mL ；V_样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500万个。

注意事项

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。

3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。

5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。