产品简介
线粒体呼吸链复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称NADH-CoQ还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ，同时可使O2还原生成O2-，是呼吸电子传递链上产生O2-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物体内线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性，其原理是线粒体呼吸链复合体Ⅰ(简称复合体Ⅰ) 能够催化NADH脱氢生成NAD+，在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂四 | 12.5mL | 25mL | -20℃避光保存 |
试剂五 | 0.5mL | 1mL | -20℃避光保存 |
试剂六 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）及恒温箱
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂六：临用前配制，48T加入1mL去离子水充分溶解，96T加入2mL去离子水充分溶解，未用完的已溶解的试剂六请分装后-20℃保存，避免反复冻融。
工作液的配制：将试剂五转移到试剂四中混合溶解；如果检测样本是哺乳动物来源，请置于37℃孵育5min；如果样本是其他物种，则置于25℃，孵育5min。
样本制备
注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。
线粒体呼吸链复合体Ⅰ的提取：
1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞，加入1mL 试剂一和10µL 试剂三，冰浴匀浆；
2. 离心匀浆液，600g, 5min, 4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；
3. 再次离心上清，11,000g, 10min, 4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作；
4. (选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅰ（此步可选做，可用于判断线粒体提取效果）；
5. 在沉淀中加入200µL试剂二和2µL试剂三，充分重悬沉淀，用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅰ酶活性检测，
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm，紫外分光光度计去离子水调零。
2. 在96孔UV微孔板或微量石英比色皿中依次加入10µL样本、15µL试剂六和200µL工作液, 轻敲板，充分混匀后,立即读取340nm处0min 初始吸光值A1和2min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于2.0）或ΔA大于 0.4，可用试剂二稀释样本后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高检测数值。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4个样本）。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
上清中线粒体呼吸链复合体 I 活力的计算：
上清的复合体 I 活力(U/g 鲜重)=[ΔA1×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=3654×ΔA1÷W
沉淀中线粒体呼吸链复合体 I 活力的计算:
线粒体沉淀的复合体 I活力(U/g 鲜重)=[ΔA2×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V重悬×V样)÷T=731×ΔA2÷W
样本中复合体 I 总活力的计算：
复合体 I 总活力即为上清中复合体 I 活力与沉淀中复合体 I 活力之和。
复合体 I总活力(U/g 鲜重)=3654×ΔA1÷W+731×ΔA2÷W
2. 按细胞数量计算
单位的定义：每1万个细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
上清中线粒体呼吸链复合体 I 活力的计算：
上清的复合体 I 活力(U/104 cell)=[ΔA1×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V提取×500)÷T=7.31×ΔA1
沉淀中线粒体呼吸链复合体 I 活力的计算:
线粒体沉淀的复合体Ⅰ活力(U/104 cell)=[ΔA2×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V重悬×500)÷T=1.46×ΔA2
样本中复合体 I 总活力的计算：
复合体 I 总活力即为上清中复合体 I 活力与沉淀中复合体 I 活力之和。
复合体 I总活力(U/104 cell)=7.31×ΔA1+1.46×ΔA2
V反总：反应体系总体积，2.25×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光径，0.5cm；109：单位换算系数，1mol=109 nmol；V样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，2min；ΔA1：上清测定值；W：样本重量，g；V提取：提取体系体积，1.01mL；ΔA2：沉淀测定值；V重悬：重悬沉淀体积，0.202mL； 500：细胞总数, 500万。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
