产品简介
线粒体呼吸链复合体Ⅰ(EC 1.6.5. 3)又称NADH-CoQ还原酶或NADH脱氢酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体内膜中最大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ,同时可使O2还原生成O2-,是呼吸电子传递链上产生O2-的主要部位。测定该酶活性,不仅可以反映呼吸电子传递链(ETC)状态,而且可以反映活性氧(ROS)生成状态。本试剂盒提供了一种简单的检测方法,用于检测生物体内线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性,其原理是线粒体呼吸链复合体Ⅰ(简称复合体Ⅰ) 能够催化NADH脱氢生成NAD+,在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂四 | 12.5mL | 25mL | -20℃避光保存 |
试剂五 | 0.5mL | 1mL | -20℃避光保存 |
试剂六 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)及恒温箱
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂六:临用前配制,48T加入1mL去离子水充分溶解,96T加入2mL去离子水充分溶解,未用完的已溶解的试剂六请分装后-20℃保存,避免反复冻融。
工作液的配制:将试剂五转移到试剂四中混合溶解;如果检测样本是哺乳动物来源,请置于37℃孵育5min;如果样本是其他物种,则置于25℃,孵育5min。
样本制备
注意:推荐使用新鲜样本,以保证酶的活力。
线粒体呼吸链复合体Ⅰ的提取:
1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞,加入1mL 试剂一和10µL 试剂三,冰浴匀浆;
2. 离心匀浆液,600g, 5min, 4℃,收集上清液至另一新的离心管中,舍弃沉淀;
3. 再次离心上清,11,000g, 10min, 4℃,沉淀即为提取的线粒体,用作第5步操作;
4. (选做)上清液即为胞浆提取物,可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅰ(此步可选做,可用于判断线粒体提取效果);
5. 在沉淀中加入200µL试剂二和2µL试剂三,充分重悬沉淀,用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅰ酶活性检测,
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm,紫外分光光度计去离子水调零。
2. 在96孔UV微孔板或微量石英比色皿中依次加入10µL样本、15µL试剂六和200µL工作液, 轻敲板,充分混匀后,立即读取340nm处0min 初始吸光值A1和2min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。
注意:1. 为保证实验结果的准确性,需先取1-2个样做预实验,如果测定的吸光值过高(高于2.0)或ΔA大于 0.4,可用试剂二稀释样本后再测定,计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA偏小,则可以通过增加加入的样本体积来提高检测数值。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)。
3. 因通过反应速率计算酶活,使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4个样本)。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
上清中线粒体呼吸链复合体 I 活力的计算:
上清的复合体 I 活力(U/g 鲜重)=[ΔA1×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=3654×ΔA1÷W
沉淀中线粒体呼吸链复合体 I 活力的计算:
线粒体沉淀的复合体 I活力(U/g 鲜重)=[ΔA2×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V重悬×V样)÷T=731×ΔA2÷W
样本中复合体 I 总活力的计算:
复合体 I 总活力即为上清中复合体 I 活力与沉淀中复合体 I 活力之和。
复合体 I总活力(U/g 鲜重)=3654×ΔA1÷W+731×ΔA2÷W
2. 按细胞数量计算
单位的定义:每1万个细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
上清中线粒体呼吸链复合体 I 活力的计算:
上清的复合体 I 活力(U/104 cell)=[ΔA1×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V提取×500)÷T=7.31×ΔA1
沉淀中线粒体呼吸链复合体 I 活力的计算:
线粒体沉淀的复合体Ⅰ活力(U/104 cell)=[ΔA2×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V重悬×500)÷T=1.46×ΔA2
样本中复合体 I 总活力的计算:
复合体 I 总活力即为上清中复合体 I 活力与沉淀中复合体 I 活力之和。
复合体 I总活力(U/104 cell)=7.31×ΔA1+1.46×ΔA2
V反总:反应体系总体积,2.25×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔UV板光径,0.5cm;109:单位换算系数,1mol=109 nmol;V样:加入样本体积,0.01mL;T:反应时间,2min;ΔA1:上清测定值;W:样本重量,g;V提取:提取体系体积,1.01mL;ΔA2:沉淀测定值;V重悬:重悬沉淀体积,0.202mL; 500:细胞总数, 500万。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。