产品简介

线粒体呼吸链复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶 Q 还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基 FAD 还原为 FADH₂，后者进一步还原氧化型辅酶Q生成还原型辅酶Q，是呼吸电子传递链的支路。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物体内线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性，其原理是线粒体呼吸链复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。

产品内容

自备耗材

酶标仪或紫外分光光度计（能测605nm处的吸光度）及恒温箱

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

制冰机、低温离心机

去离子水

匀浆器（如果是组织样本）

试剂准备

注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。

试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。

试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

试剂六：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。

工作液的配制：临用前，将试剂五转移到试剂四中混合溶解，如果检测样本是哺乳动物来源，请置于37℃孵育，5min；如果样本是其他物质，则置于25℃孵育，5min。

样本制备

注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。

线粒体呼吸链复合体Ⅱ的提取：

1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞，加入1mL试剂一和10µL试剂三，冰浴匀浆；

2. 离心匀浆液，600g，5min，4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；

3. 再次离心上清，11,000 g, 10min, 4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作；

4. (选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅱ（此步可选做，可用于判断线粒体提取效果）；

5. 在沉淀中加入200µL试剂二和2µL试剂三，充分重悬沉淀，用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅱ酶活性检测，

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长至605nm，可见分光光度计去离子水调零。

2. 在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入10µL样本、25µL试剂六和200µL工作液，轻敲板，充分混匀后，立即读取605nm处0min的初始吸光值A₁和 2min后的吸光值A₂，计算ΔA=A₁-A₂。

注意：1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1.5）或ΔA大于0.4，可用试剂二稀释样本后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA 偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高检测数值。

2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。

3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4个样本）

结果计算

A. 使用96孔板测定的计算公式

1. 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗 1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

上清中复合体Ⅱ活力的计算：

复合体Ⅱ上清活力(U/g 鲜重)=[ΔA₁×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V_提取×V_样)÷T=1130×ΔA₁÷W  

沉淀中复合体Ⅱ活力的计算:

复合体Ⅱ沉淀活力(U/g 鲜重)=[ΔA₂×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W÷V_重悬×V_样)÷T=226×ΔA₂÷W

样本复合体Ⅱ总活力的计算：

样本复合体Ⅱ总活力即为上清中复合体Ⅱ活力与沉淀中复合体Ⅱ活力之和。

按样本质量计算：复合体Ⅱ总活力(U/g 鲜重)=1130×ΔA₁÷W+226×ΔA₂÷W

2. 按细胞数量计算

单位的定义：每1万个细胞每分钟消耗1nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

上清中线粒体呼吸链复合体 I 活力的计算：

复合体Ⅱ上清活力(U/10⁴ cell)=[ΔA₁×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V_样÷V_提取×500)÷T=2.26×ΔA₁

沉淀中复合体Ⅱ活力的计算:

复合体Ⅱ沉淀活力(U/10⁴ cell)=[ΔA₂×V_反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V_样÷V_重悬×500)÷T=0.452×ΔA₂

样本复合体Ⅱ总活力的计算：

样本复合体Ⅱ总活力即为上清中复合体Ⅱ活力与沉淀中复合体Ⅱ活力之和。

按细胞数量计算：复合体Ⅱ总活力(U/10⁴ cell)=2.26×ΔA₁+0.452×ΔA₂

V_反总：反应体系总体积，2.25×10^-4L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，21×10³mol/L/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；V_样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，2min；ΔA₁：上清测定值；W：样本重量，g；V_提取：提取体系体积，1.01mL；ΔA₂：沉淀测定值；V_重悬：重悬沉淀体积，0.202 mL；500：细胞总数, 500万。

B. 使用微量玻璃比色皿进行测定的计算公式

将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可