产品简介
线粒体呼吸链复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称CoQ-细胞色素C还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C。本试剂盒提供了一种简单的检测方法，用于检测生物体内线粒体呼吸链复合体Ⅲ活性，其原理是线粒体呼吸链复合体Ⅲ把还原型CoQ的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C，与氧化型细胞色素C不同，还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，因此550nm光吸收增加速率能够反映线粒体呼吸链Ⅲ酶活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂四 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂五 | 1 | 1 | -20℃避光保存 |
试剂六 | 1.25mL | 2.5mL | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测550nm处的吸光度）及恒温箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂六：即用型；使用前，平衡到室温；分装后-20℃避光保存，避免反复冻融。
工作液的配制：临用前，将试剂五转移到试剂四中混合溶解，如果检测样本是哺乳动物来源，请置于37℃孵育5min；如果样本是其他物种，则置于25℃孵育5min。
样本制备
注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。
线粒体呼吸链复合体Ⅲ的提取：
1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞，加入1mL试剂一和10µL试剂三，冰浴匀浆；
2. 离心匀浆液，600g, 5min, 4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；
3. 再次离心上清，11,000g, 10min, 4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作；
4. (选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体呼吸链复合体Ⅲ，用于判断线粒体提取效果；
5. 在沉淀中加入200µL 试剂二和2µL 试剂三，充分重悬沉淀，用于下一步线粒体呼吸链复合体Ⅲ酶活性检测。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长至550nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 在96孔板或微量玻璃比色皿中加入25µL试剂六和200µL工作液，充分混匀后，准确反应2min，然后加入10µL样本充分混匀后，立即读取550nm处0 min的初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
注意：1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果ΔA过高（高于1.0），可用试剂二稀释样本后再测定，计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4个样本）
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1. 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g组织在反应体系中每分钟生成1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
上清中复合体Ⅲ活力的计算：
复合体Ⅲ上清活力(U/g 鲜重)= [ΔA1×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样)÷T=1243×ΔA1÷W
沉淀中复合体Ⅲ活力的计算:
复合体Ⅲ沉淀活力(U/g 鲜重)= [ΔA2×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V重悬×V样)÷T=249×ΔA2÷W
样本复合体Ⅲ总活力的计算：
样本复合体Ⅲ总活力即为上清中复合体Ⅲ活力与沉淀中复合体Ⅲ活力之和。
按样本质量计算：复合体Ⅲ总活力(U/g 鲜重)=1243×ΔA1÷W + 249×ΔA2÷W
2. 按细胞数量计算
单位的定义：每1万个细胞每分钟生成1 nmol 还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
上清中复合体Ⅲ活力的计算：
复合体Ⅲ上清活力(U/104 cell)= [ΔA1×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V提取×500)÷T=2.49×ΔA1
沉淀中复合体Ⅲ活力的计算:
复合体Ⅲ沉淀活力(U/104 cell)=[ΔA2×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V重悬×500)÷T=0.497×ΔA2
样本复合体Ⅲ总活力的计算：
样本复合体Ⅲ总活力即为上清中复合体Ⅲ活力与沉淀中复合体Ⅲ活力之和。
按细胞数量计算：复合体Ⅲ总活力(U/104 cell)=2.49×ΔA1+0.497×ΔA2
V反总：反应体系总体积，2.35×10-4L；ε：还原型细胞色素C摩尔消光系数，19.1×103mol/L/cm；d：96孔板光径，0.5cm；109：单位换算系数，1mol=109nmol；V样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，2min；ΔA1：上清测定值；W：样本重量，g；V提取：提取体系体积，1.01mL；ΔA2：沉淀测定值；V重悬：重悬沉淀体积，0.202mL；500：细胞总数, 500万。
B. 使用微量玻璃比色皿进行测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d：0.5cm 调整为 d：1cm 进行计算即可。
