产品简介
α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH；EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物、微生物和体外培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。本试剂盒提供了一种简单、方便、快速的α-KGDH活性检测方法，其原理是α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH, NADH在340nm处有特征吸收峰，根据NADH的生成速率可计算获得α-KGDH的活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | -20℃避光保存 |
试剂四 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃避光保存 |
试剂六 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计（能测340nm处的吸光度）
96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机，低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。
试剂四：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂五：临用前配制，对于48T，加入9mL 试剂四；96T加入18mL试剂四。充分混匀待用；未用完的试剂分装-20℃避光保存，避免反复冻融。
试剂六：临用前配制，对于48T，加入 0.5mL去离子水；96T加入 1mL去离子水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
样本制备
组织、细胞和真菌中胞浆蛋白与线粒体蛋白的提取:
1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞，加入1mL试剂一和10µL试剂三，冰浴匀浆；
2. 离心匀浆液，600g，5min，4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；
3. 再次离心上清，11,000 g, 10min, 4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作；
4. (选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH（此步可选做，可用于判断线粒体提取效果）；
5. 在沉淀中加入200µL试剂二和2µL试剂三，充分重悬沉淀，用于下一步α-KGDH活性检测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm。分光光度计去离子水调零。
2. 试剂五于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育10min。
3. 在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10µL样本、10μL试剂六和180μL试剂五，迅速混匀后于 340nm 检测，记录20s 和 2min20s 的吸光值，分别记为 A1和 A2，计算ΔA=A2-A1。
注意：1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量；如果ΔA大于0.3，可用试剂二稀释样品，计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本），不推荐同时测多个样本。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1．按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH上清活性(U/g 鲜重)=[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V提取×W)÷T=3,247.59×ΔA上清÷W
α-KGDH沉淀活性(U/g 鲜重)=[ΔA沉淀×V反总 ÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=649.52×ΔA沉淀÷W
总α-KGDH活性(U/g 鲜重)=α-KGDH上清活性+α-KGDH沉淀活性=3,247.59×ΔA上清÷W+649.52×ΔA沉淀÷W
2．按细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH上清活性(U/104 cells)=[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V提取×500)÷T=6.5×ΔA上清
α-KGDH沉淀活性(U/104 cells)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=1.3×ΔA沉淀
总α-KGDH活性(U/104 cells)=α-KGDH上清活性+α-KGDH沉淀活性=6.5×ΔA上清+1.3×ΔA沉淀
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数, 6.22×103 mol/L/cm；d：0.5 cm；V样：加入样本体积，0.01mL；T：反应时间，2min；ΔA上清：上清测定值；V提取：加入提取液体积，1.01 mL；W：样品质量，g；ΔA沉淀：沉淀测定值；V样总：加入试剂二和试剂三的体积，0.202 mL；500：细胞总数，500万。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
PMK1005 柠檬酸合酶(CS）检测试剂盒（微量法）
PMK1109 琥珀酸脱氢酶（SDH)检测试剂盒（微量法）
PMK1114 线粒体苹果酸脱氢酶（MDHm）检测试剂盒（微量法）
PMK1115 乳酸（LA）检测试剂盒（微量法）
PMK1116 丙酮酸（PA）检测试剂盒（微量法）
