产品简介
丙酮酸脱氢酶（PDH；EC 1.2.4.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，分布在线粒体基质中，是由三个酶组合的复合体，负责催化丙酮酸脱羧，生成乙酰辅酶A的不可逆反应。PDH是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱羧生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。本试剂盒提供了一种简单、方便、快速的PDH活性检测方法，其原理是PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致605nm光吸收的减少。通过检测605nm吸光值的下降既可计算PDH活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | -20℃避光保存 |
试剂四 | 9.5mL | 19mL | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计（能测605nm处的吸光度）
96孔板或微量比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机，低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃避光保存。
工作液：临用前配制，将试剂五全部转移到试剂四中，充分混匀溶解待用，配制好的工作液可以 4℃避光保存一周，如需长期保存，可分装后-20℃避光保存，避免反复冻融，使用前请平衡到室温。
样本制备
组织、细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的提取:
1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞，加入1mL试剂一和10µL试剂三，冰浴匀浆；
2. 离心匀浆液，600g，5min，4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；
3. 再次离心上清，11,000 g, 10min, 4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作；
4. 上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的丙酮酸脱氢酶（PDH）；
5. 在沉淀中加入200µL试剂二和2µL试剂三，充分重悬沉淀，用于下一步丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上，调节波长到605nm。分光光度计去离子水调零。
2. 工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育10min。
3. 在 96 孔板或微量比色皿中依次加入10µL 样本和190µL工作液，充分混匀后，于605nm检测，记录20s 和1min20s的吸光值，分别记为A1和A2，计算ΔA=A1-A2。
注意：1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量；如果ΔA大于0.3，可用试剂二稀释样品，计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在25℃（一般物种）或者37℃（哺乳动物）。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本），不推荐同时测多个样本。
结果计算
A. 使用 96 孔板测定的计算公式
1. 按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH上清活性(U/g 鲜重)=[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V提取×W)÷T=1923.8×ΔA上清÷W
PDH 沉淀活性(U/g 鲜重)=[ΔA沉淀×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=384.76×ΔA沉淀÷W
总PDH活性(U/g 鲜重)=PDH上清活性+PDH沉淀活性=1923.8×ΔA上清÷W+384.76×ΔA沉淀÷W
2. 按细胞数量计算：
单位的定义：每1万个细胞在反应体系中每分钟消耗1nmol 2,6-二氯靛酚定义为一个酶活性单位。
PDH上清活性(U/104 cells)=[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V提取×500)÷T=3.85×ΔA上清
PDH沉淀活性(U/104 cells)=[ΔA沉淀×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=0.77×ΔA沉淀
总PDH活性(U/104 cells)=PDH上清活性+PDH沉淀活性=3.85×ΔA上清+0.77×ΔA沉淀
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：2,6-二氯靛酚摩尔消光系数，21×103 mol/L/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL；T：反应时间，1min；ΔA上清：上清测定值；V提取：加入提取液体积，1.01mL；W：样品质量，g；ΔA沉淀：沉淀测定值；V样总：加入试剂二和试剂三的体积，0.202mL；500：细胞总数，500万。
B. 使用微量比色皿进行测定的计算公式
将上述计算公式中光径 d: 0.5cm 调整为 d: 1cm 进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
