三羧酸循环系列

线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm) 检测试剂盒

货号:PMK1114
规格:48T/96T
价格:450元/750元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物,连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH,细菌中通常只含有NAD-MDH,在真核细胞中,NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。试剂盒提供了一种简单、方便、快速的MDHm活性检测方法,其原理是NADH在340nm处有特征吸收峰,MDHm催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致340nm处光吸收下降。通过检测340nm吸光值的下降既可计算MDHm活性

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T


试剂一

50mL

100mL

4℃保存

试剂二

10mL

20mL

4℃保存

试剂三

0.75mL

1.5mL

-20℃避光保存

试剂四

10mL

20mL

4℃保存

试剂五

1

1

-20℃避光保存

 

自备耗材

酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)

96孔UV微孔或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

水浴锅制冰机,低温离心机

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。

试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂二即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;-20℃避光保存。

试剂四:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

工作液:临用前配制,对于48 T,试剂五加入9.5 mL 试剂四和0.25 mL去离子水,对于96 T,试剂五加入19 mL 试剂四和0.5 mL去离子水,充分混匀待用;未用完的试剂-20℃避光保存,避免反复冻融。

 

 

 

样本制备

组织、细胞和细菌中胞浆蛋白与线粒体蛋白的提取:

1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞,加入1mL试剂一10µL试剂三,冰浴匀浆;

2. 离心匀浆液,600g,5min,4℃,收集上清液至另一新的离心管中,舍弃沉淀;

3. 再次离心上清,11,000 g, 10min, 4℃,沉淀即为提取的线粒体,用作第5步操作;

4. (选做)上清液即为胞浆提取物,可作为样本用于测定从线粒体泄漏的线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)(此步可选做,可用于判断线粒体提取效果);

5. 在沉淀中加入200µL试剂二2µL试剂三,充分重悬沉淀,用于下一步线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)活性检测

注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。测定过程中样本和所有试剂在冰上放置,以免变性和失活。

 

实验步骤

1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm。紫外分光光度计去离子水调零。

2. 工作液37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育10min。

3. 96孔UV板或微量石英比色皿中加入5μL样本和195μL工作液,迅速混匀后于340nm检测,记录20s和1min 20s的吸光值,分别记为A1A2,计算ΔA=A1-A2

注意:1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量如果ΔA0.5,可试剂二稀释样品,计算时结果乘以稀释倍数。

2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)。

3.  因通过反应速率计算酶活,使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4-8个样本

 

结果计算

A. 使用96孔板测定的计算公式

1.按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm上清活性(U/g 鲜重)=[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(V÷V提取×W)÷T=12990.35×ΔA上清÷W  

MDHm沉淀活性(U/g 鲜重)=[ΔA沉淀×V反总 ÷(ε×d)×109]÷(V÷V样总×W)÷T=2598.07×ΔA沉淀÷W

MDHm活性(U/g 鲜重)=MDHm上清活性+MDHm沉淀活性=12990.35×ΔA上清÷W+2598.07×ΔA沉淀÷W

2. 按细胞或细菌密度计算:

单位的定义:每1万个细胞或细菌在反应体系中每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm上清活性(U/104 cells)=[ΔA上清×V反总÷(ε×d)×109]÷(V÷V提取×500)÷T=25.98×ΔA上清

MDHm沉淀活性(U/104 cells)=[ΔA沉淀×V反总÷(ε×d)×109]÷(V÷V样总×500)÷T=5.2×ΔA沉淀

MDHm活性(U/104 cells)=MDHm上清活性+MDHm沉淀活性=25.98×ΔA上清+5.2×ΔA沉淀

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数, 6.22×103 mol/L/cm;d:0.5 cm;V:加入样本体积,0.005 mL;T:反应时间,1min;ΔA上清:上清测定值;V提取:加入提取液体积,1.01 mL;W:样品质量,g;ΔA沉淀:沉淀测定值;V样总:加入试剂二试剂三的体积,0.202mL;500:细胞或细菌总数,500万。

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。

注意事项

1. 实验过程中请穿实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。

3. 试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。

勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。


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