适用样本:组织、细菌、血清(浆)或培养液等液体样本
ACP 是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、 酱油酿造、饲料等。本试剂盒提供了一种简单、快速的酸性蛋白酶检测方法,其检测原理是: 酸性条件下,ACP催化酪蛋白水解产生酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;钨蓝在680nm有特征吸收峰,通过测定其吸光度增加,来计算ACP活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
液体一 | 1mL | 2mL | 4℃保存 |
液体二 | 0.5mL | 1mL | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 2mL | 4mL | 4℃避光保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计(能测680nm处的吸光度)
水浴锅、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器
试剂准备
提取液的配制:临用前按液体一:液体二:去离子水=90μL:20μL:21mL的比例配制,现配现用,如出现白色絮状沉淀则不能用。
试剂一:临用前48T加2mL去离子水,96T加4mL 去离子水;充分溶解。未用完的试剂4度保存。
试剂二:临用前48T加入5mL提取液,96T加入10mL提取液,沸水浴中搅拌溶解,一般加热15-30分钟。该试剂为过饱和试剂,充分混匀后仍出现颗粒物不溶物,不影响使用。
试剂三:临用前48T加入10mL去离子水,96T加入20mL去离子水,充分溶解。未用完的试剂4度保存。
试剂四:即用型;使用前平衡到室温;4℃避光保存。
标准品:50μg/mL标准酪氨酸溶液,4℃保存。
样本制备
组织:称取约0.1g组织,加入1mL提取液,冰浴匀浆,8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)。
细菌或真菌:收集500万细菌或真菌到离心管内,用冷PBS清洗细菌或真菌,离心后弃上清,加入1mL 提取液,冰浴超声波破碎细菌或真菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后8,000g,4℃离心20min,取上清液,置冰上待测。
血清或培养液等液体样本:直接测定。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上,调节波长到680nm,可见光分光光度计去离子水调零。
2. 试剂一、试剂二和试剂三置于30℃水浴保温30min。
3. 样本测定(在EP管中加入下列试剂):
标准(μL) | 空白(μL) | 测定(μL) | 对照(μL) | |
样本 | 0 | 0 | 20 | 20 |
试剂一 | 0 | 0 | 0 | 40 |
试剂二 | 0 | 0 | 40 | 0 |
混匀后置于 30℃水浴保温10min | ||||
试剂一 | 0 | 0 | 40 | 0 |
试剂二 | 0 | 0 | 0 | 40 |
混匀后 8000g,4℃离心 10min;取 40μL上清液,加入新的 EP管 | ||||
上清 | 0 | 0 | 40 | 40 |
去离子水 | 0 | 40 | 0 | 0 |
标准品 | 40 | 0 | 0 | 0 |
试剂三 | 200 | 200 | 200 | 200 |
试剂四 | 40 | 40 | 40 | 40 |
混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于96孔板或微量玻璃比色皿,测定680nm处的吸光值。计算ΔA测=A测-A对,ΔA标=A标-A空。每个测定管需设一个对照,标准和空白只需要测一次。
注意:1.实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果A测大于0.3,样本可用去离子水进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1.按照样本质量计算
单位的定义:30℃每g组织在反应体系每分钟催化水解酪素产生1ug酪氨酸为1个酶活单位。
ACP活性(U/g 鲜重)= C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=15×(ΔA测÷ΔA标)÷W
2.按照蛋白浓度计算
单位的定义:30℃每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化水解酪素产生1ug酪氨酸为1个酶活单位。
ACP活性(U/mg prot)=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(Cpr×V样)÷T=15×(ΔA测÷ΔA标)÷Cpr
3.按照液体体积计算
单位的定义:30℃每mL样品在反应体系中每分钟催化水解酪素产生1ug酪氨酸为1个酶活单位。
ACP 活性(U/mL)=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷V样÷T=15×(ΔA测÷ΔA标)
4.按细菌或真菌细胞数量计算
单位的定义:30℃每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化水解酪素产生1ug酪氨酸为1个酶活单位。
ACP 活性(U/104 cells)= C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T= 0.03×(ΔA测÷ΔA标)
C标:标准溶液浓度,50μg/mL;V反总:反应体系总体积,0.06mL;W:样本质量,g;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细菌或真菌细胞总数,500万。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。