适用样本：组织、细菌、血清（浆）或培养液等液体样本
ACP 是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、 酱油酿造、饲料等。本试剂盒提供了一种简单、快速的酸性蛋白酶检测方法，其检测原理是： 酸性条件下，ACP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，通过测定其吸光度增加，来计算ACP活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
液体一 | 1mL | 2mL | 4℃保存 |
液体二 | 0.5mL | 1mL | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 2mL | 4mL | 4℃避光保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测680nm处的吸光度）
水浴锅、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器
试剂准备
提取液的配制：临用前按液体一：液体二：去离子水=90μL：20μL：21mL的比例配制，现配现用，如出现白色絮状沉淀则不能用。
试剂一：临用前48T加2mL去离子水，96T加4mL 去离子水；充分溶解。未用完的试剂4度保存。
试剂二：临用前48T加入5mL提取液，96T加入10mL提取液，沸水浴中搅拌溶解，一般加热15-30分钟。该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物，不影响使用。
试剂三：临用前48T加入10mL去离子水，96T加入20mL去离子水，充分溶解。未用完的试剂4度保存。
试剂四：即用型；使用前平衡到室温；4℃避光保存。
标准品：50μg/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。
样本制备
组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）。
细菌或真菌：收集500万细菌或真菌到离心管内，用冷PBS清洗细菌或真菌，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细菌或真菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心20min，取上清液，置冰上待测。
血清或培养液等液体样本：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到680nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 试剂一、试剂二和试剂三置于30℃水浴保温30min。
3. 样本测定（在EP管中加入下列试剂）：
标准（μL） | 空白（μL） | 测定（μL） | 对照（μL） | |
样本 | 0 | 0 | 20 | 20 |
试剂一 | 0 | 0 | 0 | 40 |
试剂二 | 0 | 0 | 40 | 0 |
混匀后置于 30℃水浴保温10min | ||||
试剂一 | 0 | 0 | 40 | 0 |
试剂二 | 0 | 0 | 0 | 40 |
混匀后 8000g，4℃离心 10min；取 40μL上清液，加入新的 EP管 | ||||
上清 | 0 | 0 | 40 | 40 |
去离子水 | 0 | 40 | 0 | 0 |
标准品 | 40 | 0 | 0 | 0 |
试剂三 | 200 | 200 | 200 | 200 |
试剂四 | 40 | 40 | 40 | 40 |
混匀后置于30℃水浴保温20min，取200μL于96孔板或微量玻璃比色皿，测定680nm处的吸光值。计算ΔA测=A测-A对，ΔA标=A标-A空。每个测定管需设一个对照，标准和空白只需要测一次。
注意：1.实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果A测大于0.3，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1.按照样本质量计算
单位的定义：30℃每g组织在反应体系每分钟催化水解酪素产生1ug酪氨酸为1个酶活单位。
ACP活性（U/g 鲜重）= C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=15×(ΔA测÷ΔA标)÷W
2.按照蛋白浓度计算
单位的定义：30℃每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化水解酪素产生1ug酪氨酸为1个酶活单位。
ACP活性（U/mg prot）=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷（Cpr×V样）÷T=15×(ΔA测÷ΔA标)÷Cpr
3.按照液体体积计算
单位的定义：30℃每mL样品在反应体系中每分钟催化水解酪素产生1ug酪氨酸为1个酶活单位。
ACP 活性（U/mL）=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷V样÷T=15×(ΔA测÷ΔA标)
4.按细菌或真菌细胞数量计算
单位的定义：30℃每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化水解酪素产生1ug酪氨酸为1个酶活单位。
ACP 活性（U/104 cells）= C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T= 0.03×(ΔA测÷ΔA标)
C标：标准溶液浓度，50μg/mL；V反总：反应体系总体积，0.06mL；W：样本质量，g；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细菌或真菌细胞总数，500万。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
