脂肪酸系列

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)检测试剂盒

货号:PMK1145
规格:48T/96T
价格:1020元/1700元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A,是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

ACC广泛存在于生物界在许多所知的乙酰辅酶A羧化酶中,对大肠杆菌中的酶了解得最清楚。试剂盒可检测生物体内ACC活性,其原理是ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰辅酶A、ATP和无机磷,通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来计算ACC活性。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T

试剂一

50mL

100mL

4℃保存

试剂二

1mL

2mL

4℃避光保存

试剂三

10mL

10mL

4℃保存

试剂四

粉剂×1瓶

粉剂×1瓶

4℃保存

试剂五

粉剂×1瓶

粉剂×1瓶

-20℃保存

试剂六

粉剂×1瓶

粉剂×1瓶

4℃避光保存

试剂七

粉剂×1瓶

粉剂×1瓶

4℃避光保存

试剂八

25mL

25mL

室温保存

标准品10μmol/mL 标准磷贮备液

1mL

1mL

4℃保存

自备耗材

酶标仪可见分光光度计(能测660nm处的吸光度)

96孔板或微量玻璃比色皿可调节式移液枪及枪头

恒温箱低温离心机制冰机

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。

提取液的配制临用前1mL试剂一中加入10µL试剂二的比例配制提取液。根据样本数量现用现配。   

试剂:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂:临用前加入2.5mL试剂充分溶解混匀溶解后的试剂可4℃保存一周,也可分装-20长期保存,避免反复冻融。

试剂:临用前加入2mL去离子水,充分溶解混匀。溶解后的试剂可4℃保存一周,也可分装-20℃长期保存,避免反复冻融。

试剂:临用前加25mL去离子水溶解;4℃避光保存。溶解后的试剂可4℃保存一周,也可分装-20℃长期保存,避免反复冻融。

试剂:临用前加25mL去离子水溶解;4℃避光保存。溶解后的试剂可4℃保存一周,也可分装-20℃长期保存,避免反复冻融。

1μmol/mL标准磷应用液配制:将标准品(10μmol/mL 标准磷贮备液10倍稀释,如取0.1mL试剂七加0.9mL去离子水充分混匀。

定磷试剂的配制:按去离子水:试剂六:试剂七:试剂八=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色,若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配,根据需要用多少配多少。  

注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

样本制备

动物组织:称取0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。

植物组织:称取0.1g样本,加入1mL 提取液捣碎,冰浴超声波破碎5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。

细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL提取液,冰浴超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。

血清(浆)等液体样本:直接测定。

注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到660nm,可见分光光度计去离子水调零。

2. 将试剂37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。

3. 酶促反应EP管中依次加入下列试剂):


对照μL)

定管μL)

试剂

90

0

试剂

0

50

试剂

0

40

样本

10

10

37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应30min后,90℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失),冷却后,10000g 25℃离心5min,取上清

4. 定磷(在96孔板微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂):


标准孔μL)

空白孔μL)

对照μL)

定孔μL)

1μmol/mL标准磷应用液

20

0

0

0

去离子水

0

20

0

0

上清液

0

0

20

20

定磷试剂

180

180

180

180

混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)保温30min,测定660nm吸光值。分别记为A标准A空白A对照A测定,计算ΔA=A标准-A空白ΔA=A测定-A对照标准、空白只要做一次即可,每个测定需要设一个对照管。

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.005可适当加大样本量。如果A测定大于2,样本可用提取液适当稀释,计算结果乘以稀释倍数。

结果计算

1. 按样本鲜重计算:

定义:每小时每g组织在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。

ACC(μmol/h/g鲜重)=(C×V反总ΔA÷ΔA÷(W×V÷V样总)÷T=2ΔA÷ΔA÷W

2. 按液体体积计算:

定义:每小时每mL液体样本在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。

ACC(μmol/h/mL)=(C×V反总ΔA÷ΔA÷V÷T=2ΔA÷ΔA

3. 按组织蛋白浓度计算:

定义:每小时每毫克组织蛋白在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。

ACC(μmol/h/mg prot)==(C×V反总ΔA÷ΔA÷(V×Cpr)÷T=2ΔA÷ΔA÷Cpr

4. 按细菌或细胞密度计算:

定义:每小时每500万细菌或细胞在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。

ACC (U/104 cells)=(C×V反总ΔA÷ΔA÷(500×V÷V样总)÷T=0.04×ΔA÷ΔA

C:标准浓度,1μmol/mLV反总:酶促反应总体积,0.1mL;V:加入样本体积,0.01mL ;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,0.5小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项

1. 实验过程中请穿实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。

3. 试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。

5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。

 


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