产品简介
乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACC）在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
ACC广泛存在于生物界，在许多所知的乙酰辅酶A羧化酶中，对大肠杆菌中的酶了解得最清楚。本试剂盒可检测生物体内ACC活性，其原理是ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰辅酶A、ATP和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来计算ACC活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂三 | 10mL | 10mL | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂六 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
试剂七 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
试剂八 | 25mL | 25mL | 室温保存 |
标准品（10μmol/mL 标准磷贮备液） | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测660nm处的吸光度）
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液的配制：临用前按1mL试剂一中加入10µL试剂二的比例配制提取液。根据样本数量现用现配。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂四：临用前加入2.5mL试剂三充分溶解混匀。溶解后的试剂可4℃保存一周，也可分装-20℃长期保存，避免反复冻融。
试剂五：临用前加入2mL去离子水，充分溶解混匀。溶解后的试剂可4℃保存一周，也可分装-20℃长期保存，避免反复冻融。
试剂六：临用前加25mL去离子水溶解；4℃避光保存。溶解后的试剂可4℃保存一周，也可分装-20℃长期保存，避免反复冻融。
试剂七：临用前加25mL去离子水溶解；4℃避光保存。溶解后的试剂可4℃保存一周，也可分装-20℃长期保存，避免反复冻融。
1μmol/mL标准磷应用液配制：将标准品（10μmol/mL 标准磷贮备液）10倍稀释，如取0.1mL试剂七加0.9mL去离子水充分混匀。
定磷试剂的配制：按去离子水:试剂六:试剂七:试剂八=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配，根据需要用多少配多少。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
样本制备
动物组织：称取0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
植物组织：称取0.1g样本，加入1mL 提取液捣碎，冰浴超声波破碎5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）等液体样本：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 将试剂三、四、五在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。
3. 酶促反应（在EP管中依次加入下列试剂）：
对照管（μL） | 测定管（μL） | |
试剂三 | 90 | 0 |
试剂四 | 0 | 50 |
试剂五 | 0 | 40 |
样本 | 10 | 10 |
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应30min后，90℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g 25℃离心5min，取上清。
4. 定磷（在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂）：
标准孔（μL） | 空白孔（μL） | 对照孔（μL） | 测定孔（μL） | |
1μmol/mL标准磷应用液 | 20 | 0 | 0 | 0 |
去离子水 | 0 | 20 | 0 | 0 |
上清液 | 0 | 0 | 20 | 20 |
定磷试剂 | 180 | 180 | 180 | 180 |
混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）保温30min，测定660nm吸光值。分别记为A标准、A空白、A对照，A测定，计算ΔA标=A标准-A空白，ΔA测=A测定-A对照。标准孔、空白孔只要做一次即可，每个测定管需要设一个对照管。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.005可适当加大样本量。如果A测定大于2，样本可用提取液适当稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 按样本鲜重计算：
定义：每小时每g组织在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。
ACC(μmol/h/g鲜重)=(C标×V反总)×（ΔA测÷ΔA标）÷(W×V样÷V样总)÷T=20×（ΔA测÷ΔA标）÷W
2. 按液体体积计算：
定义：每小时每mL液体样本在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。
ACC(μmol/h/mL)=(C标×V反总)×（ΔA测÷ΔA标）÷V样÷T=20×（ΔA测÷ΔA标）
3. 按组织蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。
ACC(μmol/h/mg prot)==(C标×V反总)×（ΔA测÷ΔA标）÷(V样×Cpr)÷T=20×（ΔA测÷ΔA标）÷Cpr
4. 按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每500万细菌或细胞在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。
ACC (U/104 cells)=(C标×V反总)×（ΔA测÷ΔA标）÷(500×V样÷V样总)÷T=0.04×（ΔA测÷ΔA标）
C标：标准品浓度，1μmol/mL；V反总：酶促反应总体积，0.1mL；V样：加入样本体积，0.01mL ；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500万。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
