产品简介
乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A,是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
ACC广泛存在于生物界,在许多所知的乙酰辅酶A羧化酶中,对大肠杆菌中的酶了解得最清楚。本试剂盒可检测生物体内ACC活性,其原理是ACC能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3和ATP生成丙二酰辅酶A、ATP和无机磷,通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来计算ACC活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂三 | 10mL | 10mL | 4℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂六 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
试剂七 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
试剂八 | 25mL | 25mL | 室温保存 |
标准品(10μmol/mL 标准磷贮备液) | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计(能测660nm处的吸光度)
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
恒温箱、低温离心机、制冰机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。
提取液的配制:临用前按1mL试剂一中加入10µL试剂二的比例配制提取液。根据样本数量现用现配。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂四:临用前加入2.5mL试剂三充分溶解混匀。溶解后的试剂可4℃保存一周,也可分装-20℃长期保存,避免反复冻融。
试剂五:临用前加入2mL去离子水,充分溶解混匀。溶解后的试剂可4℃保存一周,也可分装-20℃长期保存,避免反复冻融。
试剂六:临用前加25mL去离子水溶解;4℃避光保存。溶解后的试剂可4℃保存一周,也可分装-20℃长期保存,避免反复冻融。
试剂七:临用前加25mL去离子水溶解;4℃避光保存。溶解后的试剂可4℃保存一周,也可分装-20℃长期保存,避免反复冻融。
1μmol/mL标准磷应用液配制:将标准品(10μmol/mL 标准磷贮备液)10倍稀释,如取0.1mL试剂七加0.9mL去离子水充分混匀。
定磷试剂的配制:按去离子水:试剂六:试剂七:试剂八=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色,若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配,根据需要用多少配多少。
注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
样本制备
动物组织:称取0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
植物组织:称取0.1g样本,加入1mL 提取液捣碎,冰浴超声波破碎5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL提取液,冰浴超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
血清(浆)等液体样本:直接测定。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到660nm,可见分光光度计去离子水调零。
2. 将试剂三、四、五在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。
3. 酶促反应(在EP管中依次加入下列试剂):
对照管(μL) | 测定管(μL) | |
试剂三 | 90 | 0 |
试剂四 | 0 | 50 |
试剂五 | 0 | 40 |
样本 | 10 | 10 |
37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应30min后,90℃水浴5min(盖紧,以防止水分散失),冷却后,10000g 25℃离心5min,取上清。
4. 定磷(在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂):
标准孔(μL) | 空白孔(μL) | 对照孔(μL) | 测定孔(μL) | |
1μmol/mL标准磷应用液 | 20 | 0 | 0 | 0 |
去离子水 | 0 | 20 | 0 | 0 |
上清液 | 0 | 0 | 20 | 20 |
定磷试剂 | 180 | 180 | 180 | 180 |
混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)保温30min,测定660nm吸光值。分别记为A标准、A空白、A对照,A测定,计算ΔA标=A标准-A空白,ΔA测=A测定-A对照。标准孔、空白孔只要做一次即可,每个测定管需要设一个对照管。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.005可适当加大样本量。如果A测定大于2,样本可用提取液适当稀释,计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 按样本鲜重计算:
定义:每小时每g组织在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。
ACC(μmol/h/g鲜重)=(C标×V反总)×(ΔA测÷ΔA标)÷(W×V样÷V样总)÷T=20×(ΔA测÷ΔA标)÷W
2. 按液体体积计算:
定义:每小时每mL液体样本在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。
ACC(μmol/h/mL)=(C标×V反总)×(ΔA测÷ΔA标)÷V样÷T=20×(ΔA测÷ΔA标)
3. 按组织蛋白浓度计算:
定义:每小时每毫克组织蛋白在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。
ACC(μmol/h/mg prot)==(C标×V反总)×(ΔA测÷ΔA标)÷(V样×Cpr)÷T=20×(ΔA测÷ΔA标)÷Cpr
4. 按细菌或细胞密度计算:
定义:每小时每500万细菌或细胞在反应体系中产生1μmol无机磷的量为一个 ACC活力单位。
ACC (U/104 cells)=(C标×V反总)×(ΔA测÷ΔA标)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.04×(ΔA测÷ΔA标)
C标:标准品浓度,1μmol/mL;V反总:酶促反应总体积,0.1mL;V样:加入样本体积,0.01mL ;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,0.5小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500万。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。