适用样本:动植物组织、细胞、细菌、血清、血浆、培养液等液体样本
产品简介
磷脂酶C(EC3.1.4.3)是一种水解甘油磷酸酯C3位点甘油磷酸酯键的脂类水解酶,广泛存在于微生物及动植物的组织和细胞中,在细胞代谢、细胞传递、生长发育等方面具有重要作用。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法,用于分析各种生物样品中磷脂酶C的活性。其原理是磷脂酶C催化水解NPPC产生对硝基苯酚,在400nm处有特征吸收峰。通过测定吸光值升高速率来计算磷脂酶C活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 51mL | 102mL | 4℃保存 |
试剂二 | 6mL | 12mL | -20℃避光保存 |
试剂三 | 5mL | 10mL | 4℃保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计(能测400nm处的吸光度)及恒温箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
超速冷冻离心机、制冰机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
提取液:即用型;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;分装-20℃避光保存。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
标准品:标准品为5mM(μmol/mL)的对硝基苯酚溶液,使用前,平衡到室温;4℃保存。
标准曲线设置:按下表所示,用去离子水将5μmol/mL标准品稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6nmol/mL标准溶液 的标准溶液。
标准品体积(µL) | 去离子水体积(µL) | 标准品浓度(nmol/mL) | |
标准品1 | 40µL of 5μmol/mL | 160 | 1000 |
标准品2 | 100µL of 标准品1 (1000nmol/mL) | 100 | 500 |
标准品3 | 100µL of 标准品2 (500nmol/mL) | 100 | 250 |
标准品4 | 100µL of 标准品3 (250nmol/mL) | 100 | 125 |
标准品5 | 100µL of 标准品4 (125nmol/mL) | 100 | 62.5 |
标准品6 | 100µL of 标准品5 (62.5nmol/mL) | 100 | 31.25 |
标准品7 | 100µL of 标准品6 (31.25nmol/mL) | 100 | 15.6 |
注意:每次实验,请使用新配制的标准品。
样本制备
动植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液冰浴匀浆,10,000g,4℃离心5min,取全部上清100,000g,4℃离心30min,弃上清,取沉淀溶于1mL试剂一。
细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL提取液,超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),10,000g,4℃离心5min,取全部上清100,000g,4℃离心30min,弃上清,取沉淀溶于1mL试剂一。
血清(浆)或培养液等液体样本:直接测定,根据预实验确定稀释倍数。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。 如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到400nm,可见分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定:在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂
空白(μL) | 测定(μL) | 标准(μL) | |
样本 | 0 | 20 | 0 |
标准品 | 0 | 0 | 20 |
试剂一 | 20 | 0 | 0 |
试剂二 | 100 | 100 | 100 |
充分混匀,37℃孵育30min | |||
试剂三 | 80 | 80 | 80 |
充分混匀,室温静置2min后, 400nm处测定吸光值A,计算ΔA测定=A测定-A空白,ΔA标准=A标准-A空白。空白和标准曲线只需要测一次。
注意:1.实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.0样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制:
以标准品浓度为y轴,ΔA标准为x轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。将ΔA测定带入方程计算出y值(nmol/mL)。
2. 样本磷脂酶C活性计算
(1)按样本质量计算
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位U。
磷脂酶C活性(U/g 质量)=(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=0.2y÷W
(2)按液体样本体积计算
单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位U。
磷脂酶C活性(U/mL)=(y×V反总)÷V样÷T=0.2y
(3)按细菌或细胞数量计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位U。
磷脂酶C活性(U/104 cell)= (y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.0004y
(4)按蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位U。
磷脂酶C活性(U/mg prot)=(y×V反总)÷(Cpr×V样)÷T=0.2y÷Cpr
V反总:反应体系总体积,0.12mL;W:样本质量,g;V样:加入样本体积,0.02mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,30min;500:细胞或细菌总数,500万;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。
结果展示
典型标准曲线
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。
PMK1142甘油三酯(TG)检测试剂盒(微量法)
PMK1143总胆固醇(TC)检测试剂盒(微量法)
PMK1144 游离胆固醇(FC)检测试剂盒(微量法)
PMK1137游离脂肪酸(FFA)检测试剂盒(微量法)
PMK1151 血清高密度脂蛋白(HDL-C)检测试剂盒(微量法)
PMK1152 血清低密度脂蛋白(LDL-C)检测试剂盒(微量法)
PMK1141 肝脂酶(HL)检测试剂盒(微量法)
PMK1019 脂肪酸合成酶(FAS)检测试剂盒(微量法)
PMK1138 脂肪酶(LPS)检测试剂盒(微量法)
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