脂肪酸系列

ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)检测试剂盒

货号:PMK1150
规格:48T/96T
价格:1740元/2900元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACLEC4.1.3.8)是催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的关键胞质酶,其催化产生的乙酰辅酶A是合成脂肪酸与胆固醇等脂类物质的主要原料可用于脂肪酸合成和碳链延长、黄酮类物质合成、氨基酸合成等并可参与相关重要蛋白的修饰作用,是体内能源物质代谢的枢纽性物质。试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中ACL活性,其原理是ACL 在ATP和辅酶 A 存在的情况下催化柠檬酸裂解为乙酰辅酶 A、草酰乙酸、ADP及无机磷。通过测定无机磷增加速率来确定ACL活性。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T

提取液

50mL

100mL

4℃保存

试剂一

20mL

40mL

4℃保存

试剂二

粉剂×1瓶

粉剂×1瓶

-20℃保存

试剂三

粉剂×1瓶

粉剂×1瓶

4℃避光保存

试剂四

粉剂×1瓶

粉剂×1瓶

4℃避光保存

试剂五

粉剂×1瓶

粉剂×1瓶

4℃避光保存

试剂六

5mL

10mL

室温保存

标准品10mM标准磷贮备液)

1mL

1mL

4℃避光保存

自备耗材

酶标仪或分光光度计(能测660nm处的吸光度)及恒温箱

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

制冰机、低温离心机

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

注意:各组分(小管试剂)开盖前,请先低速离心。

提取液:即用型;4℃保存。

试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂二:临用前配制,48T加10mL试剂一,96T加20mL试剂一,充分混合溶解用不完的试剂分装-20℃保存,避免反复冻融

试剂三:临用前配制,48T加入2mL去离子水充分溶解,96T加入4mL去离子水充分溶解后使用。

试剂四:临用前配制,48 T加入5mL去离子水充分溶解,96T加入10mL去离子水充分溶解后使用。

试剂五:临用前配制,48 T加入5mL去离子水充分溶解,96 T加入10mL去离子水充分溶解后使用。

试剂六:即用型;室温保存。

定磷试剂的配制:配制比例按照H2O: 试剂四: 试剂五: 试剂六=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。

注意:配试剂最好用新的玻璃器皿或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

标准曲线设置按下表所示用去离子水将10mM标准磷贮备液稀释为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mM 的标准溶液。


标准品体积(µL)

去离子水体积(µL)

标准品浓度(mM)

Std.1

100µL 10mM

900

1

Std.2

100µL of Std.1 (1mM)

100

0.5

Std.3

100µL of Std.2 (0.5mM)

100

0.25

Std.4

100µL of Std.3 (0.25mM)

100

0.125

Std.5

100µL of Std.4 (0.125mM)

100

0.0625

Std.6

100µL of Std.5 (0.0625mM)

100

0.0313

Std.7

100µL of Std.6 (0.0313mM)

100

0.0156

注意:每次实验,请使用新配制的标准品。

样本制备

组织:称取0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。

细胞或菌:收集500万细胞或真菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL提取液,冰浴超声波破碎细胞或真菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。

血清(浆)等液体样本:直接测定。

注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到660nm可见分光光度计去离子水调零。

2. 试剂二37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。

3. 酶促反应(在EP管中依次加入下列试剂):


空白(μL)

标准(μL)

测定(μL)

对照(μL)

样本

0

0

10

10

试剂一

0

0

0

190

试剂二

0

0

190

0

混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确孵育10min

试剂三

0

0

20

20

混匀后,室温(25左右),4,000g,离心10min,取上清液

4. 定磷(在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂)

上清

0

0

40

40

不同浓度标准品

0

40

0

0

去离子水

40

0

0

0

定磷试剂

200

200

200

200

混匀,室温静置10min后,测定660nm吸光值。计算ΔA=A测定-A对照ΔA=A标准-A空白。(空白和标准曲线只需做1

注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量。如果A测定大于1.5,样本可用提取液适当稀释,计算结果乘以稀释倍数。

结果计算

1. 标准曲线的绘制

以标准液浓度为y轴,ΔAx轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。

2. 无机磷(Pi)含量的计算

∆A带入方程得到y值(mM=µmol/mL)。

3. ACL活性计算

1按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U。

ACLU/g 鲜重)=(y×V反总)÷(W×V÷V样总)÷T×1000=2000y÷W

2)按液体体积计算:

单位的定义:每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U

ACLU/mL)=(y×V反总)÷V÷T=2000y

3 按细胞数量计算

单位的定义:每1万个细胞在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U

ACLU/104 Cells)=(y×V反总)÷(500×V÷V样总)÷T=4y

4按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U

ACLU/mg prot)(y×V反总(V×Cpr)÷T=2000Cpr

 

V反总:反应体系总体积,0.2mL;V:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min;1000:单位换算系数,1µmol/mL=1000 nmol/mLW:样本重量,g500:细胞总数,500万Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL

结果展示

典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

         image                       

 

 









注意事项

1. 实验过程中请穿实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。

3. 试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。

勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。


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