产品简介
ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL；EC4.1.3.8）是催化柠檬酸生成乙酰辅酶A的关键胞质酶，其催化产生的乙酰辅酶A是合成脂肪酸与胆固醇等脂类物质的主要原料。可用于脂肪酸合成和碳链延长、黄酮类物质合成、氨基酸合成等，并可参与相关重要蛋白的修饰作用，是体内能源物质代谢的枢纽性物质。试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中ACL活性，其原理是ACL 在ATP和辅酶 A 存在的情况下催化柠檬酸裂解为乙酰辅酶 A、草酰乙酸、ADP及无机磷。通过测定无机磷增加速率来确定ACL活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 20mL | 40mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
试剂六 | 5mL | 10mL | 室温保存 |
标准品（10mM标准磷贮备液） | 1mL | 1mL | 4℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计（能测660nm处的吸光度）及恒温箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前配制，48T加10mL试剂一，96T加20mL试剂一，充分混合溶解。用不完的试剂分装-20℃保存，避免反复冻融。
试剂三：临用前配制，48T加入2mL去离子水充分溶解，96T加入4mL去离子水充分溶解后使用。
试剂四：临用前配制，48 T加入5mL去离子水充分溶解，96T加入10mL去离子水充分溶解后使用。
试剂五：临用前配制，48 T加入5mL去离子水充分溶解，96 T加入10mL去离子水充分溶解后使用。
试剂六：即用型；室温保存。
定磷试剂的配制：配制比例按照H2O: 试剂四: 试剂五: 试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注意：配试剂最好用新的玻璃器皿或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
标准曲线设置：按下表所示用去离子水将10mM标准磷贮备液稀释为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156 mM 的标准溶液。
标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（mM） | |
Std.1 | 100µL 10mM | 900 | 1 |
Std.2 | 100µL of Std.1 (1mM) | 100 | 0.5 |
Std.3 | 100µL of Std.2 (0.5mM) | 100 | 0.25 |
Std.4 | 100µL of Std.3 (0.25mM) | 100 | 0.125 |
Std.5 | 100µL of Std.4 (0.125mM) | 100 | 0.0625 |
Std.6 | 100µL of Std.5 (0.0625mM) | 100 | 0.0313 |
Std.7 | 100µL of Std.6 (0.0313mM) | 100 | 0.0156 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
组织：称取0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或真菌：收集500万细胞或真菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细胞或真菌5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
血清（浆）等液体样本：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 将试剂二在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。
3. 酶促反应（在EP管中依次加入下列试剂）：
空白（μL） | 标准（μL） | 测定（μL） | 对照（μL） | |
样本 | 0 | 0 | 10 | 10 |
试剂一 | 0 | 0 | 0 | 190 |
试剂二 | 0 | 0 | 190 | 0 |
混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确孵育10min | ||||
试剂三 | 0 | 0 | 20 | 20 |
混匀后，室温（25℃左右），4,000g，离心10min，取上清液 | ||||
4. 定磷(在96孔板或微量玻璃比色皿中加入下列试剂） | ||||
上清 | 0 | 0 | 40 | 40 |
不同浓度标准品 | 0 | 40 | 0 | 0 |
去离子水 | 40 | 0 | 0 | 0 |
定磷试剂 | 200 | 200 | 200 | 200 |
混匀，室温静置10min后，测定660nm吸光值。计算ΔA测=A测定-A对照，ΔA标=A标准-A空白。（空白和标准曲线只需做1次） | ||||
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于 0.01可适当加大样本量。如果A测定大于1.5，样本可用提取液适当稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制
以标准液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
2. 无机磷（Pi）含量的计算
将∆A测带入方程得到y值（mM=µmol/mL）。
3. ACL活性计算
（1）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U。
ACL（U/g 鲜重）＝(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T×1000=2000y÷W
（2）按液体体积计算：
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U。
ACL（U/mL）＝(y×V反总)÷V样÷T=2000y
（3） 按细胞数量计算
单位的定义：每1万个细胞在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U。
ACL（U/104 Cells）＝(y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T=4y
（4）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位U。
ACL（U/mg prot）＝(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=2000y÷Cpr
V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10min；1000：单位换算系数，1µmol/mL=1000 nmol/mL；W：样本重量，g；500：细胞总数，500万；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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