产品简介
肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)又称为肉碱脂酰转移酶，是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶A将酰基转移至L-肉毒碱的反应，在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。 本试剂盒可检测生物样本中CPT1活性，其原理是基于肉碱和脂酰辅酶A在丙二酰辅酶A存在与否的条件下，通过肉碱脂酰转移酶(CPT1)的作用，产生脂酰肉碱，并释放出巯基辅酶A(COA-SH)，与Ellman试剂DNTB反应后，产生黄色的TNB。通过其吸收峰值得变化（412nm），来定量分析CPT1的活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48 T | 96 T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂四 | 15mL | 30mL | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂六 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测412nm处的吸光度）
制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水、无水乙醇
匀浆器或研钵（如果是组织样本）
试剂准备
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂四：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂五：使用前48T加入0.5mL无水乙醇，混匀，再加入11mL试剂四，混匀；96T加入1mL无水乙醇，混匀，再加入22mL试剂四，混匀。37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂六：使用前48T加入0.5mL去离子水，混匀；96T加入1mL去离子水，混匀。37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
样本制备
组织、真菌菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞，加入1mL试剂一和10µL试剂三，冰浴匀浆；
2. 离心匀浆液，600g, 5min, 4℃，收集上清液至另一新的离心管中，舍弃沉淀；
3. 再次离心上清，11,000g, 10min, 4℃，沉淀即为提取的线粒体，用作第5步操作；
4. (选做)上清液即为胞浆提取物，可作为样本用于测定从线粒体泄漏的CPT1（此步可选做，可用于判断线粒体提取效果）；
5. 在沉淀中加入200µL试剂二和2µL试剂三，充分重悬沉淀，用于下一步CPT1酶活性检测。
注意：推荐使用新鲜样本，以保证酶的活力。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上，调节波长到412nm。分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定：在96孔板或微量玻璃比色皿中加入10μL样本、220μL试剂五和10μL试剂六，混匀，记录412nm处20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于0.6，样本可用试剂二进一步稀释（计算结果乘以稀释倍数），或减少提取用样本量。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式如下：
（1）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT1（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（W×V样÷V样总）÷T=356.5×ΔA÷W
（2）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1765×ΔA÷Cpr
（3）按真菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT1（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷（500×V样÷V样总）÷T=0.713×ΔA
V反总：反应体系总体积，2.4×10-4 L；ε：TNB摩尔消光系数，1.36×104 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500万。
B.使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
