产品简介
肉毒碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)又称为肉碱脂酰转移酶,是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶A将酰基转移至L-肉毒碱的反应,在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。 本试剂盒可检测生物样本中CPT1活性,其原理是基于肉碱和脂酰辅酶A在丙二酰辅酶A存在与否的条件下,通过肉碱脂酰转移酶(CPT1)的作用,产生脂酰肉碱,并释放出巯基辅酶A(COA-SH),与Ellman试剂DNTB反应后,产生黄色的TNB。通过其吸收峰值得变化(412nm),来定量分析CPT1的活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48 T | 96 T | ||
试剂一 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂二 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂三 | 1mL | 2mL | 4℃避光保存 |
试剂四 | 15mL | 30mL | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂六 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃避光保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计(能测412nm处的吸光度)
制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水、无水乙醇
匀浆器或研钵(如果是组织样本)
试剂准备
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
试剂四:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂五:使用前48T加入0.5mL无水乙醇,混匀,再加入11mL试剂四,混匀;96T加入1mL无水乙醇,混匀,再加入22mL试剂四,混匀。37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂六:使用前48T加入0.5mL去离子水,混匀;96T加入1mL去离子水,混匀。37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
样本制备
组织、真菌菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
1. 准确称取0.1g组织或收集500万个细胞,加入1mL试剂一和10µL试剂三,冰浴匀浆;
2. 离心匀浆液,600g, 5min, 4℃,收集上清液至另一新的离心管中,舍弃沉淀;
3. 再次离心上清,11,000g, 10min, 4℃,沉淀即为提取的线粒体,用作第5步操作;
4. (选做)上清液即为胞浆提取物,可作为样本用于测定从线粒体泄漏的CPT1(此步可选做,可用于判断线粒体提取效果);
5. 在沉淀中加入200µL试剂二和2µL试剂三,充分重悬沉淀,用于下一步CPT1酶活性检测。
注意:推荐使用新鲜样本,以保证酶的活力。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上,调节波长到412nm。分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定:在96孔板或微量玻璃比色皿中加入10μL样本、220μL试剂五和10μL试剂六,混匀,记录412nm处20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA大于0.6,样本可用试剂二进一步稀释(计算结果乘以稀释倍数),或减少提取用样本量。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式如下:
(1)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT1(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=356.5×ΔA÷W
(2)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT1(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr) ÷T=1765×ΔA÷Cpr
(3)按真菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CPT1(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.713×ΔA
V反总:反应体系总体积,2.4×10-4 L;ε:TNB摩尔消光系数,1.36×104 L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。
B.使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。