产品简介
SSS(EC 2.4.1.21)通常以游离态存在于质体基质中,催化淀粉链延长,主要负责支链淀粉的合成。本试剂盒提供了一种简便的比色测定法,用于测定样本中的SSS活性。其原理是SSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上,同时生成ADP,在反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH,NADPH生成量与前一步反应中ADP生成量呈正比,340nm下测定NADPH增加量即可计算SSS活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 20mL | 40mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂五 | 50uL | 100uL | -20℃保存 |
试剂六 | 50uL | 100uL | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计(能测340nm处的吸光度)及恒温箱
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
注意:小管试剂开盖前,请先低速离心。
提取液:即用型;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂二:临用前48T加入7mL试剂一,96T加入14mL试剂一,充分混匀备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂三:临用前48T加入4mL试剂一,96T加入8mL试剂一,充分混匀备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂四:临用前48T加入5mL试剂一,96T加入10mL试剂一,充分混匀备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂五:临用前48T加入250μL去离子水,96T加入500μL去离子水,充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
试剂六:临用前48T加入250μL去离子水,96T加入500μL去离子水,充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。
样本制备
植物组织:称取0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆。10,000g,4℃离心10min, 取上清置冰上待测。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm, 紫外分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定:在EP依次加入下列试剂
试剂名称 | 测定(μL) | 对照(μL) |
样本 | 75 | 75 |
试剂二 | 135 | 0 |
去离子水 | 0 | 135 |
混匀,30℃保温20min,置沸水浴中1min(盖紧,防止水分散失),冰浴冷却 | ||
试剂三 | 75 | 75 |
混匀,30℃保温30 min,置沸水浴中1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴冷却 | ||
试剂四 | 100 | 100 |
试剂五 | 5 | 5 |
试剂六 | 5 | 5 |
混匀(如果一次性测定样本较多,可以将试剂四、五和六按比例配成混合液再加入),45℃保温20min,置沸水浴中1min(盖紧,防止水分散失),冰浴冷却。10000g 4℃离心10min,取200uL上清液加入96孔板或微量石英比色皿中,测定340nm的吸光值A,计算ΔA=A测定-A对照,每个测定管需设一个对照。
注意:1.试剂二如有沉淀,加入之前要使之充分溶解混匀。
2.实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验,如果ΔA小于0.001可适当加大样本量,如果ΔA大于1.0,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数。
3.测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在对应温度。
结果计算
A.用96孔板测定的计算公式如下
(1)按样本鲜重计算:
酶活力单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SSS活性(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=45×ΔA÷W
(2)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
SSS(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=45×ΔA÷Cpr
V反总:反应体系总体积,2.1×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;109:1mol=1×109 nmol;V样:加入样本体积,0.075mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,20min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。
B.使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。