GBSS（EC 2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。本试剂盒提供了一种简便的比色测定法，用于测定样本中的GBSS活性。其原理是GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH，其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过340nm下测定NADPH的增加量，可以计算GBSS活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 100mL×1瓶 | 100mL×2瓶 | 4℃保存 |
试剂一 | 20mL | 40mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂五 | 50uL | 100uL | -20℃保存 |
试剂六 | 50uL | 100uL | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或紫外分光光度计（能测340nm处的吸光度）及恒温箱
96孔UV微孔板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
制冰机、低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：小管试剂开盖前，请先低速离心。
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前48T加入7mL试剂一，96T加入14mL试剂一，充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂三：临用前48T加入4mL试剂一，96T加入8mL试剂一，充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂四：临用前48T加入5mL试剂一，96T加入10mL试剂一，充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂五：临用前48T加入250μL去离子水，96T加入500μL去离子水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
试剂六：临用前48T加入250μL去离子水，96T加入500μL去离子水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，避免反复冻融。
样本制备
植物组织：称取0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆。10,000g,4℃离心10min, 弃上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混匀，置冰上待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或紫外分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm, 紫外分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定：在EP依次加入下列试剂
试剂名称 | 测定（μL） | 对照（μL） |
样本 | 75 | 75 |
试剂二 | 135 | 0 |
去离子水 | 0 | 135 |
混匀，30℃保温20min，置沸水浴中1min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却 | ||
试剂三 | 75 | 75 |
混匀，30℃保温30 min，置沸水浴中1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却 | ||
试剂四 | 100 | 100 |
试剂五 | 5 | 5 |
试剂六 | 5 | 5 |
混匀（如果一次性测定样本较多，可以将试剂四、五和六按比例配成混合液再加入），45℃保温20min，置沸水浴中1min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却。10000g 4℃离心10min，取200uL上清液加入96孔板或微量石英比色皿中，测定340nm的吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照，每个测定管需设一个对照。
注意：1.试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。
2.实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验，如果ΔA小于0.001可适当加大样本量，如果ΔA大于1.0，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
3.测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在对应温度。
结果计算
A.用96孔板测定的计算公式如下
（1）按样本鲜重计算：
酶活力单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
GBSS活性（U/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=45×ΔA÷W
（2）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。
GBSS（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr)÷T=45×ΔA÷Cpr
V反总：反应体系总体积，2.1×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；109:1mol=1×109 nmol；V样：加入样本体积，0.075mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，20min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。
B.使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
