产品简介
淀粉脱分支酶（starch debranching enzyme，DBE）能够专一、高效的裂解支链淀粉的α-1,6-糖苷键，产生线性的葡萄糖链，对淀粉的结构起“修饰”的作用，淀粉脱分支酶在调整支链淀粉侧链的链长方面起着关键作用，淀粉分支酶和淀粉脱分支酶的平衡使得支链淀粉合成。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中DBE酶活性，其原理是DBE催化支链淀粉产生还原糖，其与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕红色物质，通过测定其在540nm下吸光值变化可计算得DBE活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 7.5mL | 15mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 6mL | 12mL | 4℃保存 |
试剂四 | 17.5mL | 35mL | 室温避光保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光度）
水浴锅、离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：临用前96T加入6mL试剂一，48T加入3mL试剂一，充分混匀后备用；用不完的试剂4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂四：即用型，室温避光保存。若有黄色晶体析出，需 90℃加热溶解后再用。
标准品：含10 mg无水葡萄糖，临用前加入1mL去离子水溶解得10 mg/mL标准品储液。10mg/mL标准品储液可4℃保存1个月或-20℃长期保存。取40µL 10mg/mL标准品储液加360µL去离子水稀释得1mg/mL 的标准品溶液。
注意：每次实验，请使用新配制的标准品溶液。
样本制备
组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液冰浴匀浆。15,000g，4℃离心10min，取上清置冰上代测。
细胞或细菌：先收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL预冷的提取液，冰浴超声波破碎细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）.然后15,000g, 4℃离心10min，取上清置冰上待测。
液体样本：直接测定（若溶液有浑浊则离心后取上清测定）。建议预实验确定合适的稀释倍数。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存6个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 取100μL样本95℃水浴5min作为对照管使用。
3. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
试剂名称 | 空白管（μL） | 标准管（μL） | 测定管（μL） | 对照管（μL） |
去离子水 | 100 | 0 | 0 | 0 |
标准品溶液 | 0 | 100 | 0 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 100 | 0 |
95℃水浴5min样本 | 0 | 0 | 0 | 100 |
试剂一 | 100 | 100 | 0 | 100 |
试剂二 | 0 | 0 | 100 | 0 |
混匀，37℃准确保温 2h | ||||
试剂三 | 100 | 100 | 100 | 100 |
试剂四 | 300 | 300 | 300 | 300 |
混匀，95℃水浴5min，冷却，取200μL至96孔板或微量玻璃比色皿中，测定540nm处的吸光值，计算ΔA测=A测定-A对照；ΔA标=A标准-A空白。
注意：1. 每个样本需设置一个对照管，空白管和标准管只需做1次。
2. 实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本A测定大于2，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。若ΔA测定小于0.005可以重新提取样本，适当加大样本量。
3. 可以在不同对照管中加入不同样品，然后集中进行 5min 95℃沸水浴处理。
4. 37℃水浴或恒温培养箱中反应 2h后，离心管底部可能有沉淀，无需离心，直接进入下一步试验即可。
结果计算
DBE酶活性计算
1. 按样本鲜重计算
单位定义：每g组织在反应体系中每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活性(U/g 质量)=C标×（ΔA测÷ΔA标）×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×n=（ΔA测÷ΔA标）÷W×n
2. 按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活性（U/mg prot）=C标×（ΔA测÷ΔA标）×V反总÷(Cpr×V样)÷T×n=（ΔA测÷ΔA标）÷Cpr×n
3. 按细胞或细菌数量计算
单位定义：每104个细胞在反应体系中每小时分解支链淀粉产生1mg 葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活性（U/104 cells）=C标×（ΔA测÷ΔA标）×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T×n
=（ΔA测÷ΔA标）÷500×n=0.002×（ΔA测÷ΔA标）×n
4. 按液体样本体积计算
单位定义：每毫升液体样本在反应体系中每小时分解支链淀粉产生1mg 葡萄糖为1个酶活力单位。
DBE酶活性(U/mL)=C标×（ΔA测÷ΔA标）×V反总÷V样÷T×n=（ΔA测÷ΔA标）×n
C标：标准品溶液浓度，1mg/mL；V反总：反应体系总体积，0.2mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；V样总：样本总体积，1mL；T：反应时间，2h；n：样本进一步稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细菌或细胞总数，500万个。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
