淀粉系列

淀粉脱分支酶(DBE)检测试剂盒

货号:PMK1161
规格:48T/96T
价格:1080元/1800元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

淀粉脱分支酶(starch debranching enzyme,DBE)能够专一、高效的裂解支链淀粉的α-1,6-糖苷键,产生线性的葡萄糖链,对淀粉的结构起“修饰”的作用,淀粉脱分支酶在调整支链淀粉侧链的链长方面起着关键作用,淀粉分支酶和淀粉脱分支酶的平衡使得支链淀粉合成。本试剂盒提供了一种简单的比色法来检测生物样本中DBE酶活性,其原理是DBE催化支链淀粉产生还原糖,其与3,5-二硝基水杨酸反应生成棕红色物质,通过测定其在540nm下吸光值变化可计算得DBE活性。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T

提取液

50mL

100mL

4℃保存

试剂一

7.5mL

15mL

4℃保存

试剂二

粉剂×1

粉剂×1

4℃保存

试剂三

6mL

12mL

4℃保存

试剂四

17.5mL

35mL

室温避光保存

标准品

粉剂×1支

粉剂×1支

4℃保存

自备耗材

酶标仪或可见光分光光度计(能测540nm处的吸光度)

水浴锅、离心机

96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

提取液即用型4℃保存。

试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存

试剂二:临用前96T加入6mL试剂一,48T加入3mL试剂一,充分混匀后备用;用不完的试剂4℃保存

试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存

试剂四:即用型室温避光保存若有黄色晶体析出,需 90℃加热溶解后再用。

标准品:含10 mg无水葡萄糖,临用前加入1mL去离子水溶解得10 mg/mL标准品储液。10mg/mL标准品储液可4℃保存1个月或-20℃长期保存。取40µL 10mg/mL标准品储液加360µL去离子水稀释得1mg/mL 的标准品溶液。

注意:每次实验,请使用新配制的标准溶液

样本制备

组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液冰浴匀浆15,000g,4℃离心10min,取上清置冰上代测。

细胞或细菌:先收集500细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL预冷的提取液,冰浴超声波破碎细胞5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次).然后15,000g, 4℃离心10min,取上清置冰上待测。

液体样本:直接测定(若溶液有浑浊则离心后取上清测定)。建议预实验确定合适的稀释倍数。

注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存6个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用Bradford法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。

实验步骤

1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上,调节波长到540nm,可见分光光度计去离子水调零。

2. 100μL样本955min作为对照管使用。

3. 样本测定(在EP管中依次加入下列试剂):

试剂名称

空白管(μL)

标准管(μL)

测定管(μL)

对照管(μL)

去离子水

100

0

0

0

标准品溶液

0

100

0

0

样本

0

0

100

0

955min样本

0

0

0

100

试剂一

100

100

0

100

试剂二

0

0

100

0

混匀,37℃准确保温 2h

试剂三

100

100

100

100

试剂四

300

300

300

300

混匀,955min,冷却,取200μL至96孔板或微量玻璃比色皿中,测定540nm处的吸光值,计算ΔA=A测定-A对照ΔA=A标准-A空白

注意1. 每个样本需设置一个对照管,空白管和标准管只需做1

2. 实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本A测定大于2,样本可用提取液进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数。若ΔA测定小于0.005可以重新提取样本适当加大样本量

3. 可以在不同对照管中加入不同样品,然后集中进行 5min 95℃沸水浴处理。

4. 37℃水浴或恒温培养箱中反应 2h后,离心管底部可能有沉淀,无需离心,直接进入下一步试验即可。

结果计算

DBE活性计算

1. 按样本鲜重计算

单位定义:每g组织在反应体系中小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。

 DBE酶活性(U/g 质量)=C×(ΔA÷ΔA×V反总÷(W×V÷V样总)÷T×n=ΔA÷ΔA÷W×n  

2. 按样本蛋白浓度计算

单位定义:每mg组织蛋白在反应体系中小时分解支链淀粉产生1mg葡萄糖为1个酶活力单位。

DBE酶活性U/mg prot)=C×(ΔA÷ΔA×V反总÷(Cpr×V)÷T×n=ΔA÷ΔA÷Cpr×n  

3. 按细胞或细菌数量计算

单位定义:每104个细胞在反应体系中每小时分解支链淀粉产生1mg 葡萄糖为1个酶活力单位。

DBE酶活性U/104 cells=C×(ΔA÷ΔA×V反总÷(500×V÷V样总)÷T×n

=ΔA÷ΔA÷500×n=0.002×ΔA÷ΔA×n  

4. 按液体样本体积计算

单位定义:每升液体样本在反应体系中每小时分解支链淀粉产生1mg 葡萄糖为1个酶活力单位。

DBE酶活性(U/mL)=C×(ΔA÷ΔA×V反总÷V÷T×n=ΔA÷ΔA×n    

C标准品溶液浓度,1mg/mLV反总:反应体系总体积0.2mL;V:加入反应体系中样本体积,0.1mL;W:样本质量,g;V样总:样本总体积,1mL;T:反应时间2hn:样本进一步稀释倍数;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL500:细菌或细胞总数,500万个

注意事项

1. 实验过程中请穿实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。

3. 试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。

勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。


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