产品简介
蔗糖酶（EC 3.2.1.26）是碳水化合物消化吸收的关键酶之一，特异地催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解, 具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖 , 也能催化棉子糖水解, 生成密二糖和果糖。蔗糖酶广泛存在于动植物和微生物中，在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用．并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。本试剂盒提供了一种检测蔗糖酶活性的便捷方法，其原理是蔗糖酶水解蔗糖水解生成还原糖，3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在540nm有特征吸收峰。在一定范围内酶活力大小与还原糖的量也就是反应液540nm吸光度成正比。测定540nm吸光度的变化可计算蔗糖酶活力。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 1mL | 2mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
试剂三 | 1.5mL | 3mL | 常温避光保存 |
标准品（10mg葡萄糖） | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光度）
水浴锅、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液: 即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二: 临用前48T加入0.5mL去离子水，96T加入1mL去离子水充分溶解待用；用不完的试剂可4℃保存一周或分装-20长期保存。
试剂三: 即用型；常温避光保存，若有黄色晶体析出，需 90℃加热溶解后再用。
标准品：含10 mg无水葡萄糖，临用前加入1mL去离子水溶解得10 mg/mL标准品。溶解后的标准品可4℃保存1个月或分装-20℃长期保存。
标准曲线设置：按下表所示，用去离子水将10mg/mL标准品稀释为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313mg/mL 的标准溶液。
标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（mg/mL） | |
标准品1 | 40µL 10mg/mL | 160 | 2 |
标准品2 | 100µL of 标准品1 (2mg/mL) | 100 | 1 |
标准品3 | 100µL of 标准品2 (1mg/mL) | 100 | 0.5 |
标准品4 | 100µL of 标准品3 (0.5mg/mL) | 100 | 0.25 |
标准品5 | 100µL of 标准品4 (0.25mg/mL) | 100 | 0.125 |
标准品6 | 100µL of 标准品5 (0.125mg/mL) | 100 | 0.0625 |
标准品7 | 100µL of 标准品6 (0.0625mg/mL) | 100 | 0.0313 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
动植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞、细菌或真菌：收集5×106个细胞、细菌或真菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞、细菌或真菌，离心后弃上清，加入1mL提取液，超声波破碎细胞、细菌或真菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
试剂（μL） | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
试剂一 | 15 | 15 | 15 | 15 |
去离子水 | 0 | 15 | 0 | 30 |
样本 | 30 | 30 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 0 | 30 | 0 |
试剂二 | 15 | 0 | 15 | 15 |
混匀，25℃准确水浴10min | ||||
试剂三 | 30 | 30 | 30 | 30 |
沸水浴中煮沸10min左右（盖紧，以防止水分散失），冷却至室温 | ||||
去离子水 | 210 | 210 | 210 | 210 |
混匀，取200μL 至96孔板或微量玻璃比色皿中，540nm下测定各管吸光值。标准曲线和空白管只要测定一次。每个测定管需要设一个对照管。空白孔记为A空，标准孔记为A标，测定孔记为A测，对照孔记为A对。计算ΔA测=A测-A对，ΔA标=A标-A空
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.01可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.2或者A测大于2.0，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制：
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
将ΔA测带入方程得到 y（mg/mL）。
2. 蔗糖酶活性计算
（1）按照样本鲜重计算
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化蔗糖水解生成1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖酶（U/g 质量）=y×V反总×103÷(V样÷V样总×W)÷T=200y÷W
（2）按细胞、细菌或真菌数量计算
单位定义：每1万个细胞、细菌或真菌在反应体系中每分钟催化蔗糖水解生成1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖酶（U/104cells）=y×V反总×103÷(V样÷V样总×500)÷T=0.4y
（3）按照蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化蔗糖水解生成1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
蔗糖酶（U/mg prot）=y×V反总×103÷(V样×Cpr)÷T=200y÷Cpr
V反总：反应总体积，0.06mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.03mL；V样总：加入提取液体积，1mL；103：单位换算系数，1mg=103µg；W：样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T ：反应时间：10min；500：细胞、细菌或真菌数量，500万。
结果展示
典型标准曲线
