产品简介
蔗糖是源（叶片等）光合产物向“库”器官运输的主要形态。蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是双向反应酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代谢的关键酶之一。其分解活性可以催化蔗糖水解成UDPG与果糖，参与淀粉、纤维素和半纤维素的合成等代谢途径。研究其分解方向 SS-Ⅰ的活性对于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意义。本试剂盒提供了一种检测SS-I活性的便捷方法，其原理是SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游离果糖和UDPG，果糖与3,5－二硝基水杨酸反应生成在540nm有特征吸收峰的棕红色物质，通过测定540nm 处吸光值变化可计算得 SS-I活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 5mL | 10mL | 4℃保存 |
试剂二 | 2.5mL | 5mL | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1支 | 粉剂×2支 | -20℃保存 |
试剂四 | 3mL | 6mL | 常温避光保存 |
标准品（10mg 果糖） | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光度）
水浴锅、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液: 即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三: 临用前每支试剂三加入1.2mL试剂二充分溶解待用，现配现用；未用完的试剂分装-20℃保存，避免反复冻融。
试剂四: 即用型；常温避光保存，若有黄色晶体析出，需 90℃加热溶解后再用。
标准品（10mg果糖）：临用前加入1mL去离子水溶解，配成 10mg/mL 果糖溶液备用，4℃可保存一周，或分装-20℃长期保存，避免反复冻融。
标准曲线设置：按下表所示，用去离子水将10mg/mL标准品稀释为10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156 mg/mL 的标准溶液。
标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（mg/mL） | |
标准品1 | 200µL 10mg/mL | 0 | 10 |
标准品2 | 100µL of 标准品1 (10mg/mL) | 100 | 5 |
标准品3 | 100µL of 标准品2 (5mg/mL) | 100 | 2.5 |
标准品4 | 100µL of 标准品3 (2.5mg/mL) | 100 | 1.25 |
标准品5 | 100µL of 标准品4 (1.25mg/mL) | 100 | 0.625 |
标准品6 | 100µL of 标准品5 (0.625mg/mL) | 100 | 0.313 |
标准品7 | 100µL of 标准品6 (0.313mg/mL) | 100 | 0.156 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
试剂（μL） | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 10 | 10 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 0 | 10 | 0 |
去离子水 | 0 | 0 | 0 | 10 |
试剂三 | 40 | 0 | 0 | 0 |
试剂一 | 0 | 40 | 40 | 40 |
混匀，30℃准确水浴30min后，95℃水浴10min（盖紧，以防止水分散失） | ||||
试剂四 | 50 | 50 | 50 | 50 |
混匀，95℃水浴5min左右（盖紧，以防止水分散失），冷却至室温 | ||||
去离子水 | 400 | 400 | 400 | 400 |
混匀，取200μL 至96孔板或微量玻璃比色皿中，540nm下测定各管吸光值。标准和空白只需测一次。每个测定管需要设一个对照管。空白孔记为A空，标准孔记为A标，测定孔记为A测，对照孔记为A对。计算ΔA测=A测-A对，ΔA标=A标-A空
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量。如果ΔA测大于1.5，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
1. 标准曲线的绘制：
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
将ΔA测带入方程得到 y（mg/mL）。
2. SS-I 活性的计算：
（1）按样本质量计算
酶活定义：每g样本在反应体系中每分钟分解蔗糖产生1µg 果糖为1个酶活力单位。
SS-I酶活（U/g 质量）=y×V反总×103÷(V样÷V样总×W)÷T=166.67y÷W
（2）按样本蛋白浓度计算
酶活定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟分解蔗糖产生1µg果糖为1个酶活力单位。
SS-I 酶活（U/mg prot）=y×V反总×103÷（V样×Cpr）÷T=166.67y÷Cpr
V反总：反应总体积，0.05mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；103：单位换算系数，1mg=103µg；W：样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T ：反应时间：30min。
结果展示
典型标准曲线
