产品简介
蔗糖是源（叶片等）光合产物向“库”器官运输的主要形态。蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是双向反应酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代谢的关键酶之一。研究其合成方向SS-Ⅱ的活性对于植物蔗糖合成具有重要意义。本试剂盒提供了一种检测SS-Ⅱ活性的便捷方法，其原理是SS-Ⅱ催化游离果糖与葡萄糖供体UDPG反应生成蔗糖，蔗糖与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃ |
试剂一 | 1.25mL | 2.5mL | -20℃保存 |
试剂二 | 1mL | 2mL | 4℃保存 |
试剂三 | 12.5mL | 25mL | 4℃保存 |
试剂四 | 3mL | 6mL | 4℃，避光保存 |
标准品（10mg蔗糖） | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测480nm处的吸光度）
水浴锅、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液: 即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；-20℃保存。
试剂二: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂四: 即用型；使用前，平衡到室温；4℃，避光保存。
标准品：含10mg蔗糖；使用前，平衡到室温；4℃保存。使用前加入1mL去离子水充分溶解，制备10mg/mL蔗糖标准溶液待用；用不完的试剂可4℃保存一周或分装-20℃保存，避免反复冻融。
样本制备
植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到480nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
试剂（μL） | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 10 | 10 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 0 | 10 | 0 |
去离子水 | 0 | 45 | 45 | 55 |
试剂一 | 45 | 0 | 0 | 0 |
混匀，25℃准确水浴10min | ||||
试剂二 | 15 | 15 | 15 | 15 |
沸水浴中煮沸10min左右（盖紧，以防止水分散失），冷却 | ||||
试剂三 | 210 | 210 | 210 | 210 |
试剂四 | 60 | 60 | 60 | 60 |
混匀，沸水浴30min，冷却后，取200μL至96孔板或微量玻璃比色皿中，480nm下测定各管吸光值。标准管和空白管只要做一管。每个测定管需要设一个对照管。空白孔记为A空，标准孔记为A标，测定孔记为A测，对照孔记为A对。计算ΔA测=A测-A对，ΔA标=A标-A空
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.01可适当加大样本量。如果ΔA测大于0.5，样本可用提取液进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
SS-Ⅱ活性计算
1.按照样本鲜重计算
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
SS-Ⅱ活性(U/g鲜重) = C标×A测÷ΔA标×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T=5500×A测÷ΔA标÷W
2.按照蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
SS-Ⅱ活性(U/mg prot)= C标×A测÷ΔA标×V反总÷(V样×Cpr)÷T=5500×A测÷ΔA标÷Cpr
C标：标准品浓度，10mg/mL=10000μg/mL；V反总：反应总体积，0.055mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T ：反应时间：10min。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
