产品简介
蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适pH，将高等植物Ivr分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两种类型。 NI主要存在于细胞质中，负责分解细胞质中蔗糖为果糖和葡萄糖。本试剂盒提供了一种检测NI活性的便捷方法，其原理是NI催化蔗糖分解产生还原糖，进一步与3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在540nm有特征光吸收，在一定范围内540nm光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算NI活性.
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 10mL | 20mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 7.5mL | 15mL | 常温避光保存 |
标准品（10mg葡萄糖） | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测540nm处的吸光度）
水浴锅、制冰机、低温离心机
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
去离子水
匀浆器
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液: 即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二: 临用前48T加入5mL试剂一，96T加入10mL试剂一充分溶解待用；用不完的试剂可4℃保存一周或分装-20长期保存。
试剂三: 即用型；常温避光保存，若有黄色晶体析出，需 90℃加热溶解后再用。
标准品：含10mg无水葡萄糖，临用前加入1mL去离子水溶解得10mg/mL标准品储液。溶解后的标准品可4℃保存1个月或分装-20℃长期保存。取40µL 10mg/mL标准品储液加160µL去离子水混匀得到2mg/mL标准品。
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，12,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
注意：建议使用新鲜样本。如果不立即使用，可将样品在-80℃下保存一个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用Bradford蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白（1mg/mL），所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
实验步骤
1. 酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见光分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）：
试剂（μL） | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 50 | 50 | 0 | 0 |
试剂一 | 0 | 200 | 0 | 0 |
试剂二 | 200 | 0 | 200 | 200 |
标准品 | 0 | 0 | 50 | 0 |
去离子水 | 0 | 0 | 0 | 50 |
混匀，37℃准确水浴30min后，95℃水浴10min（盖紧，以防水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变） | ||||
试剂三 | 125 | 125 | 125 | 125 |
混匀，95℃水浴10min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀，吸取200μL于96孔板或者微量比 色皿中，测定540nm 处各管的吸光值，空白孔记为A空，标准孔记为A标，测定孔记为A测，对照孔记为A对。计算ΔA测=A测-A对，ΔA标=A标-A空。标准管和空白管只需测定一次，每个测定管需要设一个对照管。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量。如果A测大于2.0，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数，或减少提取用样本量。
结果计算
NI酶活性计算
1. 按照样本鲜重计算
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化蔗糖水解生成1μg 还原糖定义为一个酶活力单位。
NI酶活（U/g 质量）= C标×（A测÷ΔA标）×V反总×103÷(V样÷V样总×W)÷T=333.33×（A测÷ΔA标）÷W
2. 按照蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化蔗糖水解生成1μg还原糖定义为一个酶活力单位。
NI酶活（U/mg prot）=C标×（A测÷ΔA标）×V反总×103÷(V样×Cpr)÷T=333.33×（A测÷ΔA标）÷Cpr
C标：标准品浓度，2mg/mL；V反总：反应总体积，0.25mL；V样：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；103：单位换算系数，1mg=103µg；W：样本鲜重，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；T ：反应时间：30min。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
