产品简介
CL（EC 3.2.1.4）存在于细菌、真菌和动物体内，能够催化羧甲基纤维素降解，是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。本试剂盒采用蒽酮比色法测定CL催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量，计算CL酶活。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 3mL | 6mL | 4℃保存 |
试剂二 | 20mL | 40mL | 4℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 |
标准品（10mg葡萄糖） | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测620nm处的吸光度）
96孔板或微量玻璃比色皿，可调节式移液枪及枪头
制冰机，离心机，水浴锅
去离子水，浓硫酸
匀浆器
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液: 即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：临用前48T加入2.5mL去离子水和22.5mL浓硫酸，96T加入5mL去离子水和45mL浓硫酸，充分溶解待用；4℃避光保存。
标准品：含10mg无水葡萄糖，临用前加入1mL去离子水溶解。配制成10mg/mL标准溶液备用，4℃可保存1周，也可分装-20℃长期保存。
标准曲线设置：按下表所示用去离子水将10mg/mL标准溶液稀释为 0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的标准溶液。
标准品体积 | 去离子水体积 | 浓度 | |
Std.1 | 40µL 10mg/mL | 960µL | 0.4mg/mL |
Std.2 | 400µL of Std.1 (0.4mg/mL) | 400µL | 0.2mg/mL |
Std.3 | 400µL of Std.2 (0.2mg/mL) | 400µL | 0.1mg/mL |
Std.4 | 400µL of Std.3 (0.1mg/mL) | 400µL | 0.05mg/mL |
Std.5 | 400µL of Std.4 (0.05mg/mL) | 400µL | 0.025mg/mL |
Std.6 | 400µL of Std.5 (0.025mg/mL) | 400µL | 0.0125mg/mL |
Std.7 | 400µL of Std.6 (0.0125mg/mL) | 400µL | 0.00625mg/mL |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
液体样本：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到620nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 操作表（在EP管中）：
对照管（μL） | 测定管（μL） | 标准管（μL） | 空白管（μL） | |
样本 | 50 | 50 | 0 | 0 |
试剂一 | 0 | 90 | 0 | 0 |
试剂二 | 370 | 370 | 0 | 0 |
去离子水 | 180 | 90 | 0 | 0 |
37℃振荡反应1h后，90℃水浴15min（盖紧，防止水分散失），冷却后 8000,g 25℃离心10min，取上清，得糖化液 | ||||
糖化液 | 140 | 140 | 0 | 0 |
标准液 | 0 | 0 | 140 | 0 |
去离子水 | 0 | 0 | 0 | 140 |
试剂三 | 260 | 260 | 260 | 260 |
混匀，90℃水浴10min（盖紧，防止水分散失），冷却至室温后，取200μL转移至微量玻璃比色皿或96孔板中，于620nm处分别读取空白管、标准管、对照管和测定管吸光值，计算ΔA测=A测定-A对照，ΔA标=A标准-A空白。
注意：空白管和标准曲线只需测定1次，每个测定管设一个对照管。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果A测定大于2.0，需要将样本用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。由于浓硫酸具有强腐蚀性，请谨慎操作。
结果计算
1．标准曲线的绘制：
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标准为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
将ΔA测带入方程得到y（mg/mL）。
2．CL活性计算
1）按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL活力(U/g鲜重)=1000×y×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=200×y÷W
2）按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL活力(U /104cells)=1000×y×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T=0.4×y
3）按液体体积计算
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每分钟催化产生1μg葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL活力(U/mL)=1000×y×V反总÷V样÷T=200×y
4）按照蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。
CL活力(U /mg prot)=1000×y×V反总÷(Cpr×V样)÷T=200×y÷Cpr
1000：单位换算1mg/mL=1000ug/mL；V反总：反应体系总体积，0.6mL；V样：加入样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，60min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；；500：细菌或细胞总数，500万。
结果展示
典型标准曲线
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
