产品简介
α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法，用于分析各种生物样品中α-GAL的活性。其原理是α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 2mL | 4mL | 4℃保存 |
试剂三 | 6.5mL | 13mL | 4℃保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计（能测400nm处的吸光度）及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
离心机、制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：临用前48T加入1.25mL去离子水,96T加入2.5mL去离子水;充分溶解备用；用不完的试剂分装-20℃保存。
试剂二：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂三：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
标准品：标准品为5mM（μmol/mL）的对硝基苯酚溶液，使用前，平衡到室温；4℃保存。
标准曲线设置：按下表所示，用去离子水将5μmol/mL标准品稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6nmol/mL标准溶液 的标准溶液。
标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（nmol/mL） | |
标准品1 | 40µL of 5μmol/mL | 160 | 1000 |
标准品2 | 100µL of 标准品1 (1000nmol/mL) | 100 | 500 |
标准品3 | 100µL of 标准品2 (500nmol/mL) | 100 | 250 |
标准品4 | 100µL of 标准品3 (250nmol/mL) | 100 | 125 |
标准品5 | 100µL of 标准品4 (125nmol/mL) | 100 | 62.5 |
标准品6 | 100µL of 标准品5 (62.5nmol/mL) | 100 | 31.25 |
标准品7 | 100µL of 标准品6 (31.25nmol/mL) | 100 | 15.6 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
动植物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液匀浆，15,000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL提取液，超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），15,000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。
血清（浆）或培养液等液体样本:直接测定，根据预实验确定稀释倍数。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。 如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到400nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定：在96孔板或微量玻璃比色皿中依次加入下列试剂
标准（μL） | 空白（μL） | 测定（μL） | 对照（μL） | |
试剂一 | 25 | 25 | 25 | 0 |
去离子水 | 0 | 10 | 0 | 25 |
试剂二 | 35 | 35 | 35 | 35 |
标准品 | 10 | 0 | 0 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 10 | 10 |
迅速混匀，放入37℃保温30min | ||||
试剂三 | 130 | 130 | 130 | 130 |
充分混匀， 400nm处测定吸光值A，计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。每个测定管需设一个对照，空白只需要测一次。
注意：1.实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果ΔA测大于0.6，样本可用去离子水进一步稀释，计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制：
以标准品浓度为y轴，ΔA标准为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。将 ΔA测定带入方程计算出y 值（nmol/mL）。
2、 样本α-GAL活性计算
（1）按样本质量计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位U。
α-GAL活性(U/g 质量)＝(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=14×y÷W
（2）按液体样本体积计算
单位的定义：每mL液体样本在反应体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位U。
α-GAL活性(U/mL)＝(y×V反总)÷V样÷T=14×y
（3）按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位U。
α-GAL活性(U/104 cell)= (y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.028×y
（4）按蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位U。
α-GAL活性（U/mg prot）=(y×V反总)÷(Cpr×V样)÷T=14×y÷Cpr
V反总：反应体系总体积，0.07mL；W：样本质量，0.1g；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5h；500：细胞或细菌总数，500万；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
结果展示
典型标准曲线-以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
