产品简介
木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生，能催化水解木聚糖，也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶，可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而广泛的应用于酿造和饲料工业中，中性木聚糖酶（Neutral Xylanase，NEX）一般分离自最适生长pH为 6-8 的微生物。本试剂盒可检测各种生物样本中NEX活性，其原理是 NEX在中性环境下能将木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，在沸水浴条件下进一步与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在540nm处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在540nm吸光值增加速率，可计算NEX活力。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
缓冲液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 5mL | 10mL | 4℃避光保存 |
试剂二 | 5mL | 10mL | 4℃避光保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测540nm处的吸光度）以及水浴锅
96孔板或微量玻璃比色皿，可调节式移液枪及枪头
低温离心机，制冰机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
注意：小管试剂开盖前，请先低速离心。
缓冲液：即用型；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃避光保存。
试剂二：室温避光保存，若有黄色晶体析出，需 90℃加热溶解后再用。
标准品：含10 mg木糖，临用前加入 667μL去离子水配制成 100μmol/mL的木糖标准储液，2-8℃保存 8 周或-20℃长期保存。取40µL 100μmol/mL的木糖标准储液加入360µL去离子水得10μmol/mL的标准溶液。
注意：每次实验，请使用新配制的标准溶液。
样本制备
组织样本：称取约0.1g组织，加入1mL缓冲液冰浴匀浆， 8,000g， 4℃离心10min，取上清液置冰上待测。
细菌或细胞：收集5×106个细菌或细胞到离心管内，用冷PBS清洗细菌或细胞，离心后弃上清，加入1mL 缓冲液，冰浴超声波破碎细菌或细胞5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。8,000g， 4℃离心10min，取上清液置冰上待测。
发酵液：发酵液于8000g，4℃离心15min，取上清，作为待测样品。
酶干粉：称约1mg，加1mL缓冲液溶解后置冰上待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。含还原糖较高的样本（如植物果实等）可用去离子水
进行适当稀释后再进行测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 操作表（在EP管中）：
对照管（μL） | 测定管（μL） | 标准管（μL） | 空白管（μL） | |
样本 | 60 | 60 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 0 | 60 | 0 |
去离子水 | 0 | 0 | 0 | 60 |
缓冲液 | 90 | 90 | 90 | 90 |
试剂一 | 0 | 60 | 60 | 60 |
涡旋混匀，置于50℃水浴锅中反应20min，立即沸水浴中10min灭活。(注意不要让盖子爆开，以免进水， 改变了反应体系) | ||||
试剂一 | 60 | 0 | 0 | 0 |
试剂二 | 90 | 90 | 90 | 90 |
涡旋混匀，沸水浴5min(注意不要让盖子爆开，以免进水改变了反应体系)，冷却至室温后，吸取200μL于 96孔板或微量玻璃比色皿中，尽快于540nm处分别读取空白管、标准管、对照管和测定管吸光值，计算ΔA测=A测定-A对照，ΔA标=A标准-A空白。
注意：空白管和标准曲线只需测定1次，每个测定管设一个对照管。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测大于1.0，需要将样本用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量。
结果计算
1. 按发酵液等液体的体积计算：
酶活定义：50℃，pH 9.0条件下，每mL发酵液在反应体系中每分钟分解木聚糖产生1μmol还原糖（木糖）所需的酶量为一个酶活力单位U。
NEX活力（U/mL）=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷V样÷T=1.75×(ΔA测÷ΔA标)
2. 按样本质量计算
1）酶干粉NEX活力计算
酶活定义：50℃，pH 9.0条件下，每mg酶在反应体系中每分钟分解木聚糖产生1μmol还原糖（木糖）所需的酶量为一个酶活力单位U。
NEX活力（U/mg 质量）=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(W1×V样÷V样总)÷T=1.75×(ΔA测÷ΔA标)÷W1
2) 组织中NEX活力计算
酶活定义：50℃，pH 9.0条件下，每g组织在反应体系中每分钟分解木聚糖产生1μmol还原糖（木糖）所需的酶量为一个酶活力单位U。
NEX活力（U/g 质量）=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(W2×V样÷V样总)÷T=1.75×(ΔA测÷ΔA标)÷W2
3. 按细菌或细胞数量计算：
酶活定义：50℃，pH 9.0条件下，每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟分解木聚糖产生1μmol还原糖（木糖）所需的酶量为一个酶活力单位U。
NEX活力（U/104cells）=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T=0.0035×(ΔA测÷ΔA标)
4. 按蛋白浓度计算：
NEX活力(U/mg prot)=C标×(ΔA测÷ΔA标)×V反总÷(Cpr×V样)÷T=1.75×(ΔA测÷ΔA标)÷Cpr
C标：标准溶液浓度，10μmol/mL；V反总：反应体系总体积，0.21mL；V样：加入样本体积，0.06mL；V样总：样本总体积，1mL；T：反应时间，20 min；W1：酶干粉样本质量，mg；W2：组织样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细菌或细胞总数，500万。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
