产品简介
β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、细菌和真菌等生物体,是催化木聚糖类半纤维素降解的关键酶,产物木糖可作为碳源应用于微生物发酵。另外,β-木糖苷酶还可以作为生物漂白剂应用于造纸工业,比传统的漂白法环保,具有广泛的应用价值。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法,用于分析各种生物样品中β-木糖苷酶的活性。其原理是β-木糖苷酶催化对硝基苯酚-β-D-木糖苷产生对硝基苯酚,对硝基苯酚在400nm处有特征吸收峰,测定400nm光吸收增加速率,可计算β-木糖苷酶活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 0.5mL | 1mL | 4℃避光保存 |
试剂二 | 5mL | 10mL | 4℃保存 |
试剂三 | 5mL | 10mL | 4℃保存 |
标准品 | 1mL | 1mL | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见光分光光度计(能测400nm处的吸光度)及恒温箱
96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头
离心机、制冰机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
提取液:即用型;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃避光保存。
试剂二:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂三:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
标准品:标准品为5mM(μmol/mL)的对硝基苯酚溶液,使用前,平衡到室温;4℃保存。
标准曲线设置:按下表所示,用去离子水将5μmol/mL标准品稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156μmol/mL标准溶液 的标准溶液。
标准品体积(µL) | 去离子水体积(µL) | 标准品浓度(μmol/mL) | |
标准品1 | 40µL of 5μmol/mL | 160 | 1 |
标准品2 | 100µL of 标准品1 (1μmol/mL) | 100 | 0.5 |
标准品3 | 100µL of 标准品2 (0.5μmol/mL) | 100 | 0.25 |
标准品4 | 100µL of 标准品3 (0.25μmol/mL) | 100 | 0.125 |
标准品5 | 100µL of 标准品4 (0.125μmol/mL) | 100 | 0.0625 |
标准品6 | 100µL of 标准品5 (0.0625μmol/mL) | 100 | 0.0313 |
标准品7 | 100µL of 标准品6 (0.0313μmol/mL) | 100 | 0.0156 |
注意:每次实验,请使用新配制的标准品。
样本制备
植物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液冰浴匀浆,10,000g,4℃离心20min,取上清液置冰上待测。
细菌或真菌:收集500万细菌或真菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL提取液,冰浴超声波破碎细菌或真菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),10,000g,4℃离心10min,取上清液置冰上待测。
液体样本:直接测定,根据预实验确定稀释倍数。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。 如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上,调节波长到400nm,可见分光光度计去离子水调零。
2. 样本测定:在96孔板或微量玻璃比色皿中中依次加入下列试剂
标准(μL) | 空白(μL) | 测定(μL) | 对照(μL) | |
标准品 | 40 | 0 | 0 | 0 |
去离子水 | 0 | 40 | 0 | 0 |
样本 | 0 | 0 | 40 | 40 |
试剂一 | 10 | 10 | 10 | 0 |
试剂二 | 70 | 70 | 70 | 80 |
混匀,45℃保温20min
试剂三 | 80 | 80 | 80 | 80 |
充分混匀,室温静置5min后, 400nm处测定吸光值A,计算ΔA测定=A测定-A对照,ΔA标准=A标准-A空白。每个测定管需设一个对照,空白和标准曲线只需要测一次。
注意:1.实验之前建议选择 2-3个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA测小于0.005可适当加大样本量。如果A测大于2.0,样本可用去离子水进一步稀释,计算结果乘以稀释倍数。
结果计算
1. 标准曲线的绘制:
以标准品浓度为y轴,ΔA标准为x轴,绘制标准曲线(浓度为y轴更方便计算结果)。将ΔA测定带入方程计算出y值(μmol/mL)。
2. 样本β-木糖苷酶活性计算
(1)按样本质量计算
单位的定义:45℃时每g组织在反应体系中1min内催化产生1μmol对硝基苯酚为一个酶活单位U。
β-木糖苷酶活性(U/g 质量)=(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=0.15×y÷W
(2)按液体样本体积计算
单位的定义:45℃时每mL液体样本在反应体系中1min内催化产生1μmol对硝基苯酚为一个酶活单位U。
β-木糖苷酶活性(U/mL)=(y×V反总)÷V样÷T=0.15×y
(3)按细菌或真菌细胞数量计算
单位的定义:45℃时每1万个细菌或真菌在反应体系中1min内催化产生1μmol对硝基苯酚为一个酶活单位U。
β-木糖苷酶活性(U/104 cell)= (y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.0003×y
(4)按蛋白浓度计算
单位的定义:45℃时每mg组织蛋白在反应体系中1min内催化产生1μmol对硝基苯酚为一个酶活单位U。
β-木糖苷酶活性(U/mg prot)=(y×V反总)÷(Cpr×V样)÷T=0.15×y÷Cpr
V反总:反应体系总体积,0.12mL;V样:加入样本体积,0.04mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,20min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;500:细胞或细菌总数,500万。
结果展示
典型标准曲线
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。