产品简介
糖化酶，即葡萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3），又称γ-淀粉酶，是一种外切型糖苷酶，它从淀粉的非还原性末端水解α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键，将淀粉完全水解为葡萄糖，因此广泛的应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸，甘油，淀粉糖等工业中，是我国重要的工业酶制剂之一。本试剂盒提供了一种简单易用的比色法，用于分析生物样品中糖化酶的活性。其原理是糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖，与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色化合物，在540nm处有最大光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与葡萄糖的量成正比，可测定葡萄糖的量来计算得糖化酶的活力。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
试剂二 | 10mL | 20mL | 室温避光保存 |
标准品（10mg葡萄糖） | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
自备耗材
酶标仪或可见分光光度计（能测540nm处的吸光度）
96孔板或微量玻璃比色皿，可调节式移液枪及枪头
制冰机，离心机，水浴锅
去离子水
匀浆器
试剂准备
注意：各组分（小管试剂）开盖前，请先低速离心。
提取液: 即用型；4℃保存。
试剂一：临用前96T加入 10 mL去离子水，48T加入 5 mL去离子水，上下颠倒摇晃几次，加热至溶解。溶解后的底物 4℃保存，若有沉淀析出，可70℃加热溶解后使用。
试剂二：即用型；室温避光保存；若有黄色晶体析出，需90℃加热溶解后再用。
标准品：含10mg无水葡萄糖，临用前加入1mL去离子水溶解得10mg/mL标准品。溶解后的标准品可4℃保存1个月或-20℃长期保存。
标准曲线设置：按下表所示，用去离子水将10mg/mL标准品稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156mg/mL 的标准溶液。
标准品体积（µL） | 去离子水体积（µL） | 标准品浓度（mg/mL） | |
标准品1 | 40µL 10mg/mL | 360 | 1 |
标准品2 | 200µL of 标准品1 (1mg/mL) | 200 | 0.5 |
标准品3 | 200µL of 标准品2 (0.5mg/mL) | 200 | 0.25 |
标准品4 | 200µL of 标准品3 (0.25mg/mL) | 200 | 0.125 |
标准品5 | 200µL of 标准品4 (0.125mg/mL) | 200 | 0.0625 |
标准品6 | 200µL of 标准品5 (0.0625mg/mL) | 200 | 0.0313 |
标准品7 | 200µL of 标准品6 (0.0313mg/mL) | 200 | 0.0156 |
注意：每次实验，请使用新配制的标准品。
样本制备
组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20％或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后10,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
液体样本：直接测定。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。
实验步骤
1. 酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到540nm，可见分光光度计去离子水调零。
2. 操作表（在EP管中）：
对照管（μL） | 测定管（μL） | 标准管（μL） | 空白管（μL） | |
样本 | 75 | 75 | 0 | 0 |
标准品 | 0 | 0 | 75 | 0 |
试剂一 | 0 | 75 | 0 | 0 |
去离子水 | 0 | 0 | 75 | 150 |
充分混匀，40℃反应20min | ||||
试剂二 | 150 | 150 | 150 | 150 |
试剂一 | 75 | 0 | 0 | 0 |
混匀，沸水浴5min（盖紧，防止水分散失），冷却至室温后，取200μL转移至微量玻璃比色皿或96孔板中，于540nm处分别读取空白管、标准管、对照管和测定管吸光值，计算ΔA测=A测定-A对照，ΔA标=A标准-A空白。
注意：空白管和标准曲线只需测定1次，每个测定管设一个对照管。实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果A测大于2.0，需要将样本用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。如果ΔA测小于0.001可适当加大样本量。
结果计算
1．标准曲线的绘制：
以标准溶液浓度为y轴，ΔA标准为x轴，绘制标准曲线（浓度为y轴更方便计算结果）。
将ΔA测带入方程得到y（mg/mL）。
2．糖化酶活性计算
1）按样本鲜重计算
单位的定义：40℃，PH4.6条件下，每g组织在反应体系中每小时水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量定义为一个酶活力单位U。
糖化酶活力(U/g鲜重)=y×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=6×y÷W
2）按细菌或细胞数量计算
单位的定义：40℃，PH4.6条件下，每1万个细菌或细胞在反应体系中每小时水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量定义为一个酶活力单位U。
糖化酶活力(U/104cells)=y×V反总÷(500×V样÷V样总)÷T=0.012×y
3）按液体体积计算
单位的定义：40℃，PH4.6条件下，每mL液体样本在反应体系中每小时水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量定义为一个酶活力单位U。
糖化酶活力(U/mL)=y×V反总÷V样÷T=6×y
4）按照蛋白浓度计算
单位的定义：40℃，PH4.6条件下，每mg组织蛋白在反应体系中每小时水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量定义为一个酶活力单位U。
糖化酶活力(U /mg prot)=y×V反总÷(Cpr×V样)÷T=6×y÷Cpr
V反总：反应体系总体积，0.15mL；V样：加入样本体积，0.075mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，20min,1/3h；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；；500：细菌或细胞总数，500万。
结果展示
典型标准曲线
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
