产品简介
GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，主要存在于多种微生物和高等动物的肝脏中。GCDH是一种制备高含量低聚果糖的理想用酶，同时也是临床血糖测定的诊断用酶，可广泛用于食品工业及医药工业领域中。本试剂盒提供了一种简单快速的GCDH活性检测方法，其原理是GCDH催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH，NADH在340nm处有特征吸收峰，测定340nm吸光度增加速率可以计算GCDH活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 9.5mL | 19mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计（能测340nm处的吸光度）
96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机，低温离心机
去离子水
匀浆器（如果是组织样本）
试剂准备
提取液：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
试剂一：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。
工作液的配制：临用前在试剂二中加入全部试剂一，混合溶解待用；用不完的试剂4℃可保存一周；或分装后-20℃保存，避免反复冻融。
样本制备
动物组织：称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴匀浆，8,000g，4℃离心10min，取上清液置冰上待测。
细胞或细菌：收集500万细胞或细菌到离心管内，用冷PBS清洗细胞，离心后弃上清，加入1mL 提取液，冰浴超声波破碎细胞或细菌5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），然后8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。
注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度，推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。对于脂肪含量较高的动物组织，离心后移除上层脂肪，再取上清液。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上，调节波长到340nm。分光光度计去离子水调零。
2.工作液置于37℃预热10min。
3. 在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10µL样本和190μL工作液，迅速混匀后于340nm检测，记录初始吸光值和1min后的吸光值，分别记为 A1和 A2，计算ΔA=A2-A1。
注意：1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量；如果ΔA大于0.3，可用提取液稀释样品，计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响，请控制在37℃。
3. 因通过反应速率计算酶活，使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数（通常一次测定4-8个样本），不推荐同时测多个样本。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1.按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH（U/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=6431×ΔA÷W
2.按细胞密度计算：
单位的定义：每1万个细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH（U/104 cell）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=12.86×ΔA
3.按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=6431×ΔA÷Cpr
V反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH摩尔消光系数, 6.22×103 mol/L/cm；d：96孔板光径，0.5cm；
109：1mol=1×109nmol；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验，尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究，如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途，我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用，并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用；否则，可能导致结果异常。
5. 勤换吸头，避免各组分之间的交叉污染。
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