糖代谢系列

葡萄糖脱氢酶(GCDH)检测试剂盒

货号:PMK1196
规格:48T/96T
价格:660元/1100元
库存:99
产品描述 常见问题 参考文献 相关产品推荐

产品简介

GCDH(EC 1.1.1.47)催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H,主要存在于多种微生物和高等动物的肝脏中。GCDH是一种制备高含量低聚果糖的理想用酶,同时也是临床血糖测定的诊断用酶,可广泛用于食品工业及医药工业领域中。试剂盒提供了一种简单快速的GCDH活性检测方法,其原理GCDH催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH,NADH在340nm处有特征吸收峰,测定340nm吸光度增加速率可以计算GCDH活性。

产品内容

试剂盒组分

规格

储存条件

48T

96T


提取液

50mL

100mL

4℃保存

试剂一

9.5mL

19mL

4℃保存

试剂二

粉剂×1瓶

粉剂×1瓶

-20℃保存

自备耗材

酶标仪或分光光度计(能测340nm处的吸光度)

96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头

水浴锅制冰机,低温离心机

去离子水

匀浆器(如果是组织样本)

试剂准备

提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。

工作液的配制:临用前在试剂二中加入全部试剂一,混合溶解待用;用不完的试剂4℃可保存一周;或分装后-20℃保存,避免反复冻融。

样本制备

动物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,8,000g,4℃离心10min,取上清液置冰上待测。

细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL 提取液,冰浴超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。

注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂进行样本蛋白质浓度测定对于脂肪含量较高的动物组织,离心后移除上层脂肪,再取上清液。

实验步骤

1. 酶标仪分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm。分光光度计去离子水调零。

2.工作液37℃预热10min。

3. 96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10µL样本和190μL工作液,迅速混匀后340nm检测,记录初始吸光值1min的吸光值,分别记为 A1 A2,计算ΔA=A2-A1

注意:1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量如果ΔA0.3,可提取液稀释样品,计算时结果乘以稀释倍数。

2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在37℃。

3.  因通过反应速率计算酶活,使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4-8个样本不推荐同时测多个样本

结果计算

A. 使用96孔板测定的计算公式

1.按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GCDHU/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V÷V样总×W)÷T=6431×ΔA÷W

2.按细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GCDHU/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V÷V样总×500)÷T=12.86×ΔA

3.按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

GCDHU/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V×Cpr)÷T=6431×ΔA÷Cpr

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数, 6.22×103 mol/L/cm;d:96孔板光径,0.5cm;

1091mol=1×109nmol;V:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1min; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g;500:细菌或细胞总数,500万

B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式

将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。 

注意事项

1. 实验过程中请穿实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。

2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。

3. 试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储

4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。

5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。


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