产品简介
GCDH(EC 1.1.1.47)催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H,主要存在于多种微生物和高等动物的肝脏中。GCDH是一种制备高含量低聚果糖的理想用酶,同时也是临床血糖测定的诊断用酶,可广泛用于食品工业及医药工业领域中。本试剂盒提供了一种简单快速的GCDH活性检测方法,其原理是GCDH催化D-葡萄糖和NAD生成D-葡萄糖酸和NADH,NADH在340nm处有特征吸收峰,测定340nm吸光度增加速率可以计算GCDH活性。
产品内容
试剂盒组分 | 规格 | 储存条件 | |
48T | 96T | ||
提取液 | 50mL | 100mL | 4℃保存 |
试剂一 | 9.5mL | 19mL | 4℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
自备耗材
酶标仪或分光光度计(能测340nm处的吸光度)
96孔UV板或微量石英比色皿、可调节式移液枪及枪头
水浴锅、制冰机,低温离心机
去离子水
匀浆器(如果是组织样本)
试剂准备
提取液:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
试剂一:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。
工作液的配制:临用前在试剂二中加入全部试剂一,混合溶解待用;用不完的试剂4℃可保存一周;或分装后-20℃保存,避免反复冻融。
样本制备
动物组织:称取约0.1g样本,加入1mL提取液,冰浴匀浆,8,000g,4℃离心10min,取上清液置冰上待测。
细胞或细菌:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL 提取液,冰浴超声波破碎细胞或细菌5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),然后8,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。
注意:推荐使用新鲜样本,如果不立即进行实验,样本可在-80℃保存1个月。如需测定蛋白浓度,推荐使用BCA法蛋白质定量试剂盒进行样本蛋白质浓度测定。对于脂肪含量较高的动物组织,离心后移除上层脂肪,再取上清液。
实验步骤
1. 酶标仪或分光光度计预热30min以上,调节波长到340nm。分光光度计去离子水调零。
2.工作液置于37℃预热10min。
3. 在96孔UV板或微量石英比色皿中依次加入10µL样本和190μL工作液,迅速混匀后于340nm检测,记录初始吸光值和1min后的吸光值,分别记为 A1和 A2,计算ΔA=A2-A1。
注意:1.实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果ΔA小于0.001可适当加大样本量;如果ΔA大于0.3,可用提取液稀释样品,计算时结果乘以稀释倍数。
2. 测定反应的温度对测定结果有影响,请控制在37℃。
3. 因通过反应速率计算酶活,使用96孔UV板时请根据操作速度控制一次测定的样本数(通常一次测定4-8个样本),不推荐同时测多个样本。
结果计算
A. 使用96孔板测定的计算公式
1.按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH(U/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=6431×ΔA÷W
2.按细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细胞在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=12.86×ΔA
3.按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
GCDH(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=6431×ΔA÷Cpr
V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数, 6.22×103 mol/L/cm;d:96孔板光径,0.5cm;
109:1mol=1×109nmol;V样:加入样本体积,0.01mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1min; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。
B. 使用微量石英比色皿测定的计算公式
将上述计算公式中的光径d:0.5cm调整为d:1cm进行计算即可。
注意事项
1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩和乳胶手套。请按照生物实验室的国家安全规定进行实验,尤其是在检测血样或其他体液时。
2. 本试剂盒仅用于实验室科学研究,如果本试剂盒用于临床诊断或任何其他用途,我们将不对任何后果负责。
3. 本试剂盒应在有效期内使用,并请严格按照说明书进行存储。
4. 不同批次号、不同厂家之间的组分不要混用;否则,可能导致结果异常。
5. 勤换吸头,避免各组分之间的交叉污染。
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